Racun perosak memainkan peranan penting dalam menangani kekurangan makanan global dan memerangi penyakit manusia yang dibawa oleh vektor. Walau bagaimanapun, masalah kerintangan racun perosak yang semakin meningkat memerlukan penemuan sebatian baharu yang menyasarkan sasaran yang kurang digunakan. Saluran potensi reseptor sementara (TRPV) serangga—Nanzhong (Nan) dan tidak aktif (Iav)—boleh membentuk saluran heterolog (Nan-Iav) dan terlokalisasi pada organ mekanosensori yang menjadi perantara geotropisme, pendengaran dan propriosepsi dalam serangga. Sesetengah racun perosak, seperti aphidopyrrolidone (AP), menyasarkan Nan-Iav melalui mekanisme yang tidak diketahui. AP berkesan terhadap serangga penghisap menusuk (hemipteran), menghalang pemakanan dengan mengganggu fungsi filamen. AP hanya boleh mengikat Nan, tetapi hanya Nan-Iav yang boleh berinteraksi dengan agonis, termasuk nikotinamida endogen (NAM), sekali gus mempamerkan aktiviti saluran. Walaupun potensi Nan-Iav sebagai sasaran racun serangga, sedikit yang diketahui tentang pemasangan salurannya, tapak pengikatan pengawalseliaan dan pengawalseliaan yang bergantung kepada Ca2+, yang menghalang pembangunan racun serangga selanjutnya. Dalam kajian ini, mikroskopi krio-elektron telah digunakan untuk menentukan struktur Nan-Iav dalam serangga Hemiptera dalam keadaan bebas calmodulin-ligan, serta dengan AP dan NAM di sempadan domain sitoplasma ulangan ankyrin (ARD). Anehnya, kami mendapati bahawa protein Nan itu sendiri boleh membentuk pentamer, yang distabilkan oleh interaksi ARD yang dimediasi AP. Kajian ini mendedahkan interaksi molekul antara racun serangga dan agonis dan Nan-Iav, menonjolkan kepentingan ARD dalam fungsi dan pemasangan saluran, dan meneroka mekanisme pengawalaturan Ca2+.
Berlatarbelakangkan perubahan iklim global yang semakin teruk, kemerosotan keselamatan makanan global merupakan salah satu cabaran utama abad ke-21, dengan akibat yang bertubi-tubi terhadap masyarakat.1,2Laporan Keadaan Keselamatan Makanan dan Pemakanan di Dunia 2023 (SOFI) Pertubuhan Kesihatan Sedunia menganggarkan bahawa kira-kira 2.33 bilion orang di seluruh dunia mengalami masalah keselamatan makanan yang sederhana hingga teruk, satu masalah yang telah lama berlarutan.3,4Malangnya, dianggarkan 20% hingga 30% atau lebih hasil tanaman hilang setiap tahun akibat perosak dan patogen, dan pemanasan global dijangka akan memburukkan lagi kerintangan perosak dan kerentanan tanaman.4,5,6,7,8Pembangunan racun perosak adalah penting bukan sahaja untuk melindungi tanaman daripada perosak dan mengurangkan penyebaran patogen bawaan vektor, tetapi juga untuk memerangi penyakit bawaan vektor manusia seperti demam denggi, malaria dan penyakit Chagas, yang semakin tahan terhadap racun perosak.5,9,10,11
Antara sasaran utama racun serangga neurotoksik, saluran TRPV heterotetramerik Nanchung (Nan)-Tidak Aktif (Iav) mewakili kelas sasaran racun serangga yang hanya ditemui dalam dekad yang lalu, termasuk racun serangga yang tersedia secara komersial seperti imidacloprid dan pyraclostrobin.12,13,14Racun serangga separa sintetik aphidopyrrolifen (AP) ialah produk yang baru dibangunkan dan dikomersialkan yang komponen utamanya ialah racun serangga aktif Inscalis®, yang mengikat AP pada tahap aktiviti subnanomolar.15AP mempamerkan ketoksikan akut yang rendah kepada pendebunga, serangga bermanfaat dan organisma bukan sasaran lain, dan apabila digunakan mengikut arahan label, ia boleh mengurangkan tekanan rintangan terhadap racun serangga lain.16,17,18Nan dan Iav diedarkan secara meluas merentasi spesies serangga, hanya diekspresikan bersama dalam neuron reseptor regangan korda pada antena dan anggota badan, dan penting untuk pendengaran, persepsi graviti, dan propriosepsi.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid dan piraclostrobin merangsang kompleks Nan-Iav melalui mekanisme unik, yang akhirnya menghalang transduksi isyarat proprioseptif.13,16,23Dalam serangga penghisap tebuk (hemipteran) seperti aphids dan lalat putih, kehilangan proprioception menjejaskan keupayaan mereka untuk makan, yang akhirnya membawa kepada kematian.13,24Menariknya, AP mempamerkan afiniti yang tinggi untuk kompleks Nan-Iav dan afiniti yang rendah untuk Nan sahaja. Pengikatan AP kepada Nan-Iav mendorong arus elektrik, tetapi pengikatan kepada Nan sahaja tidak merangsang aktiviti saluran. Iav itu sendiri langsung tidak mengikat kepada AP.16Ini menunjukkan bahawa Nan dan Iav mungkin terikat untuk membentuk kompleks saluran Nan-Iav yang berbeza (contohnya, dengan nisbah stoikiometrik yang berbeza atau susunan yang berbeza dalam nisbah stoikiometrik yang sama) atau AP mungkin terikat pada berbilang tapak. Tambahan pula, nikotinamida agonis semula jadi (NAM) mengikat kepada Drosophila Nan-Iav dengan afiniti mikromolar, menunjukkan kesan yang serupa dengan aphid (AP) secara in vitro.16,25dan menghalang pembiakan dan pemakanan kutu daun, akhirnya menyebabkan kematian mereka25,26Data ini menimbulkan banyak persoalan. Contohnya, masih belum jelas bagaimana heterodimer Nan-Iav terbentuk, tapak pengikatan yang digunakan untuk memodulasi molekul kecil, dan bagaimana molekul kecil ini mengawal selia fungsi saluran dengan menyekat propriosepsi. Tambahan pula, sebab-sebab mengapa Nan itu sendiri tidak aktif dan mempunyai afiniti yang rendah untuk AP, manakala heterodimer Nan-Iav aktif dan mengikat AP dengan afiniti yang lebih tinggi, masih belum jelas. Akhir sekali, sedikit yang diketahui tentang pengawalaturan fungsi Nan-Iav yang bergantung kepada Ca2+ dan bagaimana ia disepadukan ke dalam proses isyarat neuron.. 13,21
Dalam kajian ini, yang menggabungkan mikroskopi krio-elektron, elektrofisiologi dan teknik pengikatan radioligan, kami menjelaskan pemasangan Nan-Iav dan mekanisme pengikatannya pada pengawal selia molekul kecil. Tambahan pula, kami mengesan kalmodulin (CaM) yang terikat secara konstitutif pada pentamer Nan yang distabilkan oleh Iav dan AP. Keputusan ini memberikan pandangan penting tentang pengawalaturan ion kalsium dalam saluran, pemasangan saluran dan faktor yang menentukan afiniti pengikatan ligan. Lebih penting lagi, kami mengesahkan bahawa ARD memainkan peranan penting dalam proses ini. Kajian kami tentang saluran serangga lengkap yang terikat pada racun perosak pertanian yang berkaitan27, 28, 29membuka prospek untuk pembangunan industri racun perosak, meningkatkan keberkesanan dan kekhususan racun perosak, dan membolehkan penggunaan sebatian sasaran TRPV kepada spesies lain untuk menangani keselamatan makanan global dan penyebaran penyakit bawaan vektor.
Kami juga mendapati bahawa Nan-Iav dikawal oleh Ca2+, dan mekanisme pengawalaturannya dimediasi oleh CaM yang terikat secara konstitutif. Yang penting, pengawalaturan Nav yang bergantung kepada Ca2+ oleh CaM ini berbeza dengan ketara daripada mekanisme pengawalaturan saluran ion lain (contohnya, saluran Na+ yang dikawal voltan dan saluran TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Dalam saluran Nav1.2, domain C-terminal CaM secara heliks bergabung dengan domain C-terminal (CTD), dan Ca2+ mendorong pengikatan domain N-terminalnya ke bahagian distal CTD.56Dalam saluran TRPV5/6, domain C-terminal CaM mengikat kepada CTH, dan Ca2+ mendorong pemanjangan ke atas domain N-terminalnya ke dalam liang, sekali gus menyekat kebolehtelapan kation.53,54. Kami mencadangkan model untuk fungsi Nan-Iav-CaM yang dikawal Ca2+ (Rajah 4h). Dalam model ini, domain N-terminal CaM secara konstitutif mengikat kepada domain C-terminal (CTH) Iav. Dalam keadaan rehat (kepekatan [Ca2+] yang rendah), domain C-terminal CaM berinteraksi dengan Nan, menstabilkan konformasi ARD dan dengan itu menggalakkan pembukaan saluran. Pengikatan agonis/insektisida pada saluran mendorong pembukaan liang, yang membawa kepada kemasukan Ca2+. Ca2+ kemudian mengikat kepada CaM, menyebabkan penceraian domain C-terminal daripada ARD Nan. Oleh kerana menyekat pengikatan CaM pada asasnya menghapuskan kesan perencatan Ca2+, penceraian ini memodulasi mobiliti ARD, dengan itu menyebabkan perencatan atau penyahpekaan yang bergantung kepada Ca2+. Pemulihan arus saluran yang pesat selepas elusi ion kalsium (Rajah 4g) menunjukkan bahawa mekanisme ini memudahkan tindak balas pantas terhadap isyarat neuron yang dimediasi oleh Ca2+. Tambahan pula, kawasan C-terminal Iav, yang masih kurang difahami, telah dilaporkan memainkan peranan lain dalam penargetan saluran dan peraturan semasa.21
Akhir sekali, kajian kami membentangkan struktur resolusi tinggi bagi kompleks saluran TRP racun serangga-racun serangga yang penting dalam pertanian—satu penemuan yang sebelum ini tidak diketahui oleh kami. Terutamanya, kami mencirikan struktur dan fungsi saluran serangga dalam sel manusia (HEK293S GnTi–) dan bukannya dalam sel serangga. Dalam menghadapi peningkatan rintangan racun serangga dan tekanan berterusan terhadap keselamatan makanan dan patogen, kerja kami menyediakan maklumat penting yang akan memudahkan pembangunan racun serangga baharu untuk manfaat kesihatan manusia dan keselamatan makanan global. Kajian telah menunjukkan bahawa racun serangga seperti AP berkesan terhadap beberapa perosak apabila digunakan mengikut arahan label dan mempunyai ketoksikan akut yang rendah kepada pendebunga yang bermanfaat, menunjukkan keselamatan alam sekitar mereka.13,16Tambahan pula, pengujian beberapa derivatif AP pada nyamuk telah menunjukkan bahawa mereka akhirnya kehilangan keupayaan untuk terbang. Memahami bagaimana sebatian modulasi ini mengikat Nan-Iav akan memudahkan pengubahsuaian sebatian sedia ada atau pembangunan sebatian baharu untuk tujuan yang lebih berkesan dantepatkawalan perosak. Kajian kami menunjukkan bahawa antara muka ARD Nan-Iav adalah penting bukan sahaja untuk mengawal selia aktiviti sebatian endogen, racun perosak dan Ca2+-CaM, tetapi juga untuk pemasangan saluran. Kami mencadangkan bahawa mengganggu pemasangan heterodimer dengan molekul kecil mungkin merupakan pendekatan yang unik dan menjanjikan untuk membangunkan perencat saluran ion.
Daripada lapan gen ortolog, gen penuh kumbang coklat (Halyomorpha halys) Nanchung dan Inactive telah dipilih, menunjukkan kestabilan yang sangat baik dalam detergen. Gen yang disintesis telah dioptimumkan kodon untuk ekspresi manusia dan diklon ke dalam vektor pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) menggunakan tapak sekatan XhoI dan EcoRI. Ini memastikan bahawa klon berada dalam bingkai dengan tag C-terminal GFP-FLAG-10xHis dan mCherry-FLAG-10xHis, yang dibelah oleh protease HRC-3C (PPX), yang membolehkan bebasekspresiPrimer yang digunakan untuk mengklon Nanchung dan Inactive ke dalam vektor pBacMam adalah seperti berikut:
Imej mikroskopik zarah individu diperoleh pada mikroskop elektron penghantaran (FEI) Titan Krios G2 yang dilengkapi dengan kamera K3 dan penapis tenaga Gatan BioQuantum. Mikroskop dikendalikan pada 300 keV, dengan tetapan tenaga 20 eV, saiz piksel sampel 1.08 Å/piksel (pembesaran nominal 81,000x), dan kecerunan defokus antara -0.8 hingga -2.2 μm. Rakaman video dilakukan pada 40 bingkai sesaat menggunakan mikroskop Latitude S (Gatan) dengan kadar dos nominal 25 e–px−1 s−1, masa pendedahan 2.4 s, dan jumlah dos kira-kira 60 e–Å−2.
Pembetulan gerakan teraruh pancaran dan pemberat dos telah dilakukan pada filem menggunakan MotionCor2 dalam RELION 4.061. Anggaran parameter fungsi pemindahan kontras (CTF) telah dilakukan dalam cryoSPARC menggunakan kaedah anggaran CTF berasaskan tampalan62. Fotomikrograf dengan resolusi pemadanan CTF ≥4 Å dikecualikan daripada analisis seterusnya. Biasanya, subset 500–1000 fotomikrograf telah digunakan untuk pemilihan titik dalam cryoSPARC, diikuti dengan beberapa pusingan pengelasan 2D selepas ditapis untuk mendapatkan imej rujukan yang jelas untuk pemilihan zarah berasaskan templat. Zarah kemudiannya diekstrak menggunakan kotak sempadan 64 piksel dan binning 4 kali ganda. Beberapa pusingan pengelasan 2D telah dilakukan untuk mengalih keluar kategori zarah yang tidak diingini. Model 3D awal telah dibina semula menggunakan pembinaan semula ab initio dan diperhalusi menggunakan penghalusan tidak seragam dalam cryoSPARC. Pengelasan 3D telah dilakukan dalam cryoSPARC atau RELION berdasarkan heterogeniti ARD. Tiada heterogeniti domain membran yang ketara diperhatikan. Zarah-zarah telah ditapis menggunakan kaedah C1 dan C2; zarah-zarah dengan resolusi C2 yang lebih tinggi dianggap simetri berbanding C2 dan diimport ke dalam RELION untuk penambahbaikan Bayesian. Zarah-zarah tersebut kemudiannya dipindahkan kembali ke cryoSPARC untuk penambahbaikan akhir yang tidak seragam dan setempat. Resolusi akhir dan kiraan zarah ditunjukkan dalam Jadual 1.
Semasa memproses pentamer Nan+AP, kami meneroka pelbagai kaedah untuk meningkatkan resolusi domain membran (terutamanya kawasan liang), seperti penolakan isyarat dan penyamaran TMD. Walau bagaimanapun, percubaan ini tidak berjaya disebabkan oleh gangguan yang berpotensi ekstrem di kawasan liang dan heterogeniti keseluruhan TMD. Resolusi akhir dikira menggunakan topeng yang dijana secara automatik oleh kaedah pemprosesan tidak seragam dalam cryoSPARC, terutamanya menyasarkan kawasan ARD. Ini mencapai resolusi yang jauh lebih tinggi daripada domain membran (terutamanya kawasan VSLD).
Model de novo awal bagi bentuk apo bagi pepijat Nanchung dan Tidak Aktif pertama kali dijana menggunakan Coot63, dan model pepijat Nan dan Iav dijana menggunakan AlphaFold264 untuk mengenal pasti kawasan keyakinan rendah. Pemodelan Calmodulin adalah berdasarkan padanan badan tegar bagi model pengikat Ca2+ dan bebas Ca2+ dalam aksesi PDB 4JPZ56 dan 1CFD65. Model-model tersebut telah diperhalusi menggunakan penghalusan sfera untuk memastikan stereokimia yang betul dan geometri yang baik. Fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina, dan fosfatidilserina kemudiannya dimodelkan sebagai ketumpatan lipid yang ditakrifkan dengan baik, dan ligan NAM dan AP diletakkan dalam ketumpatan yang sepadan dalam simpang ketat. Fail kekangan dijana daripada rentetan SMILES bagi isoform menggunakan eLBOW dalam PHENIX66. Akhir sekali, model-model tersebut telah diperhalusi dalam ruang sebenar dalam PHENIX menggunakan carian grid tempatan dan peminimuman global dengan kekangan struktur sekunder. Pelayan MolProbity telah digunakan untuk penghalusan model dan analisis struktur, dan ilustrasi telah dilakukan menggunakan PyMOL dan UCSF Chimera X. 67,68,69 Analisis apertur telah dilakukan menggunakan pelayan HOLE,70 dan pemetaan pemuliharaan jujukan telah dilakukan menggunakan pelayan Consurf.71
Analisis statistik telah dijalankan menggunakan Igor Pro 6.2, Excel Office 365, dan GraphPad Prism 7.0. Semua data kuantitatif dibentangkan sebagai min ± ralat piawai (SEM). Ujian-t pelajar (dua hujung, tidak berpasangan) telah digunakan untuk membandingkan dua kumpulan. Analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan ujian post hoc Dunnett telah digunakan untuk membandingkan berbilang kumpulan. *P< 0.05, **P< 0.01, dan ***P< 0.001 dianggap signifikan secara statistik bergantung pada taburan data. Nilai Kd, Ki dan selang keyakinan 95% asimetrinya dikira menggunakan GraphPad Prism 10.
Untuk maklumat lanjut tentang metodologi kajian, sila lihat Ringkasan Laporan Portfolio Alam Semula Jadi yang dipautkan dalam artikel ini.
Model awal dibina menggunakan model calmodulin daripada pangkalan data PDB 4JPZ dan 1CFD. Koordinat telah didepositkan dalam Bank Data Protein (PDB) di bawah nombor aksesi 9NVN (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), 9NVO (Nan-Iav-CaM terikat kepada nikotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM terikat kepada nikotinamida dan EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM terikat kepada afenidolpirolina dan kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM terikat kepada afenidolpirolina dan EDTA), dan 9NVS (Nan pentamer terikat kepada afenidolpirolina). Imej mikroskopi krio-elektron yang sepadan didepositkan dalam Pangkalan Data Mikroskopi Elektron (EMDB) di bawah nombor aksesi berikut: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), EMD-49845 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan nikotinamida), EMD-49846 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan nikotinamida dan EDTA), EMD-49847 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan afidopirolina dan kalsium), EMD-49848 (kompleks Nan-Iav-CaM dengan afidopirolina dan EDTA), dan EMD-49849 (kompleks Nan pentamer dengan afidopirolina). Data mentah untuk analisis fungsi dibentangkan dalam kertas kerja ini.
Masa siaran: 28 Jan-2026