Ubat anthelmintik N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) telah dilaporkan menghalang AChE (acetylcholinesterase) dan mempunyai sifat karsinogenik yang berpotensi disebabkan oleh vaskularisasi yang berlebihan. Dalam makalah ini, kami menunjukkan bahawa DEET secara khusus merangsang sel endothelial yang menggalakkan angiogenesis, dengan itu meningkatkan pertumbuhan tumor. DEET mengaktifkan proses selular yang membawa kepada angiogenesis, termasuk percambahan, penghijrahan dan lekatan. Ini dikaitkan dengan peningkatan pengeluaran NO dan ekspresi VEGF dalam sel endothelial. Mendiamkan M3 atau menggunakan perencat M3 farmakologi memansuhkan semua kesan ini, menunjukkan bahawa angiogenesis yang disebabkan oleh DEET adalah sensitif M3. Eksperimen yang melibatkan isyarat kalsium dalam sel endothelial dan HEK yang mengekspresikan reseptor M3 secara berlebihan, serta kajian pengikatan dan dok, menunjukkan bahawa DEET bertindak sebagai modulator alosterik reseptor M3. Tambahan pula, DEET menghalang AChE, dengan itu meningkatkan bioavailabiliti asetilkolin dan pengikatannya kepada reseptor M3, dan meningkatkan kesan proangiogenik melalui peraturan allosterik.
EC utama telah diasingkan daripada aorta tikus Switzerland. Kaedah pengekstrakan telah diadaptasi daripada protokol Kobayashi 26 . Murine EC telah dibiakkan dalam medium EBM-2 ditambah dengan 5% FBS yang tidak diaktifkan haba sehingga laluan keempat.
Kesan dua kepekatan DEET pada percambahan HUVEC, U87MG, atau BF16F10 dianalisis menggunakan Kit Ujian Proliferasi Sel CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Secara ringkas, 5.103 sel setiap telaga telah disemai dalam plat 96-telaga, dibenarkan untuk melekat semalaman, dan kemudian dirawat dengan DEET selama 24 jam. Selepas mengeluarkan medium pertumbuhan, tambah larutan pengikat pewarna pada setiap telaga mikroplat dan eramkan sel pada suhu 37 °C selama 30 minit. Tahap pendarfluor ditentukan menggunakan pembaca mikroplat multimod Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) yang dilengkapi dengan penapis pengujaan 485 nm dan penapis pelepasan 530 nm.
HUVEC telah disemai dalam plat 96-telaga pada ketumpatan 104 sel setiap telaga. Sel telah dirawat dengan DEET selama 24 jam. Daya tahan sel dinilai menggunakan ujian MTT kolorimetrik (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai ketumpatan optik diperoleh pada pembaca plat mikro berbilang mod (Mithras LB940) pada panjang gelombang 570 nm.
Kesan DEET dikaji menggunakan ujian angiogenesis in vitro. Rawatan dengan 10-8 M atau 10-5 M DEET meningkatkan pembentukan panjang kapilari dalam HUVECs (Rajah 1a, b, bar putih). Berbanding dengan kumpulan kawalan, rawatan dengan kepekatan DEET antara 10-14 hingga 10-5 M menunjukkan bahawa panjang kapilari mencapai dataran tinggi pada 10-8 M DEET (Tambahan Rajah S2). Tiada perbezaan ketara ditemui dalam kesan proangiogenik in vitro HUVEC yang dirawat dengan DEET dalam julat kepekatan 10-8 M dan 10-5 M.
Untuk menentukan kesan DEET pada neovaskularisasi, kami melakukan kajian neovaskularisasi in vivo. Selepas 14 hari, tikus yang disuntik dengan sel endothelial yang diprakultur dengan 10-8 M atau 10-5 M DEET menunjukkan peningkatan yang ketara dalam kandungan hemoglobin (Rajah 1c, bar putih).
Tambahan pula, neovaskularisasi yang disebabkan oleh DEET telah dikaji dalam tikus yang mengandungi xenograf U87MG yang disuntik setiap hari (ip) dengan DEET pada dos yang diketahui mendorong kepekatan plasma 10-5 M, yang adalah normal pada manusia yang terdedah. dalam 23. Tumor yang boleh dikesan (iaitu tumor >100 mm3) diperhatikan 14 hari selepas suntikan sel U87MG ke dalam tikus. Pada hari ke-28, pertumbuhan tumor telah dipertingkatkan dengan ketara dalam tikus yang dirawat DEET berbanding dengan tikus kawalan (Rajah 1d, segi empat sama). Tambahan pula, pewarnaan CD31 tumor menunjukkan bahawa DEET meningkatkan kawasan kapilari dengan ketara tetapi bukan ketumpatan microvessel. (Gamb. 1e–g).
Untuk menentukan peranan reseptor muskarinik dalam percambahan yang disebabkan oleh DETA, 10-8 M atau 10-5 M DETA dengan kehadiran pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 terpilih) telah digunakan. Rawatan HUVEC. pFHHSiD menyekat sepenuhnya sifat proliferatif DETA pada semua kepekatan (Jadual 1).
Di bawah keadaan ini, kami juga mengkaji sama ada DEET akan meningkatkan panjang kapilari dalam sel HUVEC. Begitu juga, pFHHSiD menghalang panjang kapilari yang disebabkan oleh DEET dengan ketara (Rajah 1a, b, bar kelabu). Tambahan pula, eksperimen serupa dilakukan dengan M3 siRNA. Walaupun kawalan siRNA tidak berkesan dalam menggalakkan pembentukan kapilari, pembungkaman reseptor muskarinik M3 menghapuskan keupayaan DEET untuk meningkatkan panjang kapilari (Rajah 1a, b, bar hitam).
Tambahan pula, kedua-dua 10-8 M atau 10-5 M vascularization yang disebabkan oleh DEET in vitro dan neovascularization in vivo telah disekat sepenuhnya oleh pFHHSiD (Rajah 1c, d, bulatan). Keputusan ini menunjukkan bahawa DEET menggalakkan angiogenesis melalui laluan yang sensitif kepada antagonis reseptor M3 terpilih atau siRNA M3.
AChE ialah sasaran molekul DEET. Dadah seperti donepezil, yang bertindak sebagai perencat AChE, boleh merangsang EC angiogenesis in vitro dan dalam model iskemia kaki belakang tikus14. Kami menguji kesan dua kepekatan DEET pada aktiviti enzim AChE dalam HUVEC. Kepekatan DEET yang rendah (10-8 M) dan tinggi (10-5 M) mengurangkan aktiviti AChE endothelial berbanding keadaan kawalan (Rajah 2).
Kedua-dua kepekatan DEET (10-8 M dan 10-5 M) mengurangkan aktiviti asetilkolinesterase pada HUVEC. BW284c51 (10-5 M) digunakan sebagai kawalan untuk perencat acetylcholinesterase. Keputusan dinyatakan sebagai peratusan aktiviti AChE pada HUVEC yang dirawat dengan dua kepekatan DEET berbanding dengan sel yang dirawat kenderaan. Nilai dinyatakan sebagai min ± SEM daripada enam eksperimen bebas. *p <0.05 berbanding kawalan (ujian perbandingan berbilang Kruskal-Wallis dan Dunn).
Nitrik oksida (NO) terlibat dalam proses angiogenik 33, oleh itu, NO pengeluaran dalam HUVEC yang dirangsang DEET telah dikaji. Pengeluaran NO endothelial yang dirawat DEET telah meningkat berbanding dengan sel kawalan, tetapi mencapai kepentingan hanya pada dos 10-8 M (Rajah 3c). Untuk menentukan perubahan molekul yang mengawal pengeluaran NO yang disebabkan oleh DEET, ekspresi dan pengaktifan eNOS dianalisis dengan pembongkaran Barat. Walaupun rawatan DEET tidak mengubah ekspresi eNOS, ia meningkatkan fosforilasi eNOS dengan ketara di tapak pengaktifannya (Ser-1177) sambil mengurangkan tapak perencatannya (Thr-495) berbanding sel yang tidak dirawat dalam fosforilasi eNOS (Rajah 3d). Tambahan pula, nisbah eNOS terfosforilasi di tapak pengaktifan dan tapak perencatan dikira selepas menormalkan jumlah eNOS terfosforilasi kepada jumlah enzim. Nisbah ini meningkat dengan ketara dalam HUVEC yang dirawat dengan setiap kepekatan DEET berbanding dengan sel yang tidak dirawat (Rajah 3d).
Akhirnya, ungkapan VEGF, salah satu faktor proangiogenik utama, telah dianalisis oleh Western blotting. DEET meningkatkan ekspresi VEGF dengan ketara, manakala pFHHSiD menyekat sepenuhnya ungkapan ini .
Memandangkan kesan DEET adalah sensitif kepada kedua-dua sekatan farmakologi dan pengawalseliaan reseptor M3, kami menguji hipotesis bahawa DEET mungkin meningkatkan isyarat kalsium. Yang menghairankan, DEET gagal meningkatkan kalsium sitoplasma dalam HUVEC (data tidak ditunjukkan) dan HEK/M3 (Rajah 4a, b) untuk kedua-dua kepekatan yang digunakan.
Masa siaran: Dis-30-2024