Ubat anthelmintik N,N-dietil-m-toluamida (DEET) telah dilaporkan menghalang AChE (asetilkolinesterase) dan mempunyai sifat karsinogenik yang berpotensi disebabkan oleh vaskularisasi yang berlebihan. Dalam makalah ini, kami menunjukkan bahawa DEET secara khusus merangsang sel endotel yang menggalakkan angiogenesis, sekali gus meningkatkan pertumbuhan tumor. DEET mengaktifkan proses selular yang membawa kepada angiogenesis, termasuk percambahan, migrasi, dan lekatan. Ini dikaitkan dengan peningkatan penghasilan NO dan ekspresi VEGF dalam sel endotel. Penyenyapan M3 atau penggunaan perencat M3 farmakologi menghapuskan semua kesan ini, menunjukkan bahawa angiogenesis yang disebabkan oleh DEET adalah sensitif terhadap M3. Eksperimen yang melibatkan isyarat kalsium dalam sel endotel dan HEK yang mengekspresikan reseptor M3 secara berlebihan, serta kajian pengikatan dan dok, menunjukkan bahawa DEET bertindak sebagai modulator alosterik reseptor M3. Tambahan pula, DEET menghalang AChE, sekali gus meningkatkan bioavailabiliti asetilkolina dan pengikatannya kepada reseptor M3, dan meningkatkan kesan proangiogenik melalui pengawalaturan alosterik.
EC primer telah diasingkan daripada aorta tikus Swiss. Kaedah pengekstrakan telah diadaptasi daripada protokol Kobayashi 26. EC murine telah dikultur dalam medium EBM-2 yang ditambah dengan 5% FBS yang dinyahaktifkan haba sehingga laluan keempat.
Kesan dua kepekatan DEET terhadap percambahan HUVEC, U87MG, atau BF16F10 dianalisis menggunakan Kit Ujian Percambahan Sel CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Secara ringkas, 5.103 sel setiap telaga telah disemai dalam plat 96-telaga, dibiarkan melekat semalaman, dan kemudian dirawat dengan DEET selama 24 jam. Selepas menanggalkan medium pertumbuhan, tambahkan larutan pengikat pewarna ke setiap telaga mikroplat dan inkubasi sel pada suhu 37 °C selama 30 minit. Tahap pendarfluor ditentukan menggunakan pembaca mikroplat berbilang mod Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) yang dilengkapi dengan penapis pengujaan 485 nm dan penapis pancaran 530 nm.
HUVEC telah disemai dalam plat 96-telaga pada ketumpatan 104 sel setiap telaga. Sel telah dirawat dengan DEET selama 24 jam. Daya tahan sel telah dinilai menggunakan ujian MTT kolorimetrik (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai ketumpatan optik telah diperoleh pada pembaca mikroplat berbilang mod (Mithras LB940) pada panjang gelombang 570 nm.
Kesan DEET telah dikaji menggunakan ujian angiogenesis in vitro. Rawatan dengan 10-8 M atau 10-5 M DEET meningkatkan pembentukan panjang kapilari dalam HUVEC (Rajah 1a, b, bar putih). Berbanding dengan kumpulan kawalan, rawatan dengan kepekatan DEET antara 10-14 hingga 10-5 M menunjukkan bahawa panjang kapilari mencapai dataran tinggi pada 10-8 M DEET (Rajah Tambahan S2). Tiada perbezaan ketara ditemui dalam kesan proangiogenik in vitro HUVEC yang dirawat dengan DEET dalam julat kepekatan 10-8 M dan 10-5 M.
Untuk menentukan kesan DEET terhadap neovaskularisasi, kami menjalankan kajian neovaskularisasi in vivo. Selepas 14 hari, tikus yang disuntik dengan sel endotel yang dikultur terlebih dahulu dengan 10-8 M atau 10-5 M DEET menunjukkan peningkatan ketara dalam kandungan hemoglobin (Rajah 1c, bar putih).
Tambahan pula, neovaskularisasi yang disebabkan oleh DEET telah dikaji pada tikus yang mengandungi xenograft U87MG yang disuntik setiap hari (ip) dengan DEET pada dos yang diketahui mendorong kepekatan plasma 10-5 M, yang normal pada manusia yang terdedah. pada 23. Tumor yang dapat dikesan (iaitu tumor >100 mm3) diperhatikan 14 hari selepas suntikan sel U87MG ke dalam tikus. Pada hari ke-28, pertumbuhan tumor meningkat dengan ketara pada tikus yang dirawat DEET berbanding tikus kawalan (Rajah 1d, segi empat sama). Tambahan pula, pewarnaan CD31 pada tumor menunjukkan bahawa DEET meningkatkan luas kapilari dengan ketara tetapi bukan kepadatan mikrovaskular. (Rajah 1e–g).
Untuk menentukan peranan reseptor muskarinik dalam percambahan yang disebabkan oleh DETA, 10-8 M atau 10-5 M DETA dengan kehadiran pFHHSiD (10-7 M, antagonis reseptor M3 terpilih) telah digunakan. Rawatan HUVEC. pFHHSiD menyekat sepenuhnya sifat percambahan DETA pada semua kepekatan (Jadual 1).
Di bawah keadaan ini, kami juga mengkaji sama ada DEET akan meningkatkan panjang kapilari dalam sel HUVEC. Begitu juga, pFHHSiD menghalang panjang kapilari yang disebabkan oleh DEET dengan ketara (Rajah 1a, b, bar kelabu). Tambahan pula, eksperimen serupa telah dilakukan dengan siRNA M3. Walaupun siRNA kawalan tidak berkesan dalam menggalakkan pembentukan kapilari, pembungkaman reseptor muskarinik M3 menghapuskan keupayaan DEET untuk meningkatkan panjang kapilari (Rajah 1a, b, bar hitam).
Tambahan pula, kedua-dua vaskularisasi in vitro dan neovaskularisasi in vivo yang disebabkan oleh 10-8 M atau 10-5 M DEET telah disekat sepenuhnya oleh pFHHSiD (Rajah 1c, d, bulatan). Keputusan ini menunjukkan bahawa DEET menggalakkan angiogenesis melalui laluan yang sensitif kepada antagonis reseptor M3 terpilih atau siRNA M3.
AChE ialah sasaran molekul DEET. Ubat-ubatan seperti donepezil, yang bertindak sebagai perencat AChE, boleh merangsang angiogenesis EC secara in vitro dan dalam model iskemia kaki belakang tikus14. Kami menguji kesan dua kepekatan DEET terhadap aktiviti enzim AChE dalam HUVEC. Kepekatan DEET yang rendah (10-8 M) dan tinggi (10-5 M) mengurangkan aktiviti AChE endotel berbanding keadaan kawalan (Rajah 2).
Kedua-dua kepekatan DEET (10-8 M dan 10-5 M) mengurangkan aktiviti asetilkolinesterase pada HUVEC. BW284c51 (10-5 M) telah digunakan sebagai kawalan untuk perencat asetilkolinesterase. Keputusan dinyatakan sebagai peratusan aktiviti AChE pada HUVEC yang dirawat dengan dua kepekatan DEET berbanding dengan sel yang dirawat dengan kenderaan. Nilai dinyatakan sebagai min ± SEM bagi enam eksperimen bebas. *p < 0.05 berbanding dengan kawalan (ujian perbandingan berganda Kruskal-Wallis dan Dunn).
Nitrik oksida (NO) terlibat dalam proses angiogenik 33, oleh itu, penghasilan NO dalam HUVEC yang dirangsang oleh DEET telah dikaji. Penghasilan NO endotel yang dirawat dengan DEET meningkat berbanding sel kawalan, tetapi mencapai keertian hanya pada dos 10-8 M (Rajah 3c). Untuk menentukan perubahan molekul yang mengawal penghasilan NO yang disebabkan oleh DEET, ekspresi dan pengaktifan eNOS telah dianalisis melalui Western blotting. Walaupun rawatan DEET tidak mengubah ekspresi eNOS, ia meningkatkan fosforilasi eNOS dengan ketara pada tapak pengaktifannya (Ser-1177) sambil mengurangkan tapak perencatannya (Thr-495) berbanding sel yang tidak dirawat dalam fosforilasi eNOS (Rajah 3d). Tambahan pula, nisbah eNOS terfosforilasi pada tapak pengaktifan dan tapak perencatan telah dikira selepas menormalkan jumlah eNOS terfosforilasi kepada jumlah keseluruhan enzim. Nisbah ini meningkat dengan ketara dalam HUVEC yang dirawat dengan setiap kepekatan DEET berbanding sel yang tidak dirawat (Rajah 3d).
Akhir sekali, ekspresi VEGF, salah satu faktor proangiogenik utama, dianalisis melalui Western blotting. DEET meningkatkan ekspresi VEGF dengan ketara, manakala pFHHSiD menyekat sepenuhnya ekspresi ini.
Oleh kerana kesan DEET sensitif terhadap kedua-dua sekatan farmakologi dan penurunan regulasi reseptor M3, kami menguji hipotesis bahawa DEET mungkin meningkatkan isyarat kalsium. Anehnya, DEET gagal meningkatkan kalsium sitoplasma dalam HUVEC (data tidak ditunjukkan) dan HEK/M3 (Rajah 4a, b) untuk kedua-dua kepekatan yang digunakan.
Masa siaran: 30 Dis-2024