Dalam kajian ini, kesan rangsangan rawatan gabunganpengatur pertumbuhan tumbuhan(2,4-D dan kinetin) dan nanopartikel oksida besi (Fe₃O₄-NP) terhadap morfogenesis in vitro dan penghasilan metabolit sekunder dalam *Hypericum perforatum* L. telah dikaji. Rawatan yang dioptimumkan [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] telah meningkatkan parameter pertumbuhan tumbuhan dengan ketara: ketinggian tumbuhan meningkat sebanyak 59.6%, panjang akar sebanyak 114.0%, bilangan tunas sebanyak 180.0%, dan berat segar kalus sebanyak 198.3% berbanding kumpulan kawalan. Rawatan gabungan ini juga meningkatkan kecekapan regenerasi (50.85%) dan meningkatkan kandungan hiperisin sebanyak 66.6%. Analisis GC-MS mendedahkan kandungan hiperosida, β-patolena, dan alkohol setil yang tinggi, menyumbang 93.36% daripada jumlah kawasan puncak, manakala kandungan jumlah fenolik dan flavonoid meningkat sebanyak 80.1%. Keputusan ini menunjukkan bahawa pengatur pertumbuhan tumbuhan (PGR) dan nanopartikel Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) memberikan kesan sinergi dengan merangsang organogenesis dan pengumpulan sebatian bioaktif, yang mewakili strategi yang menjanjikan untuk penambahbaikan bioteknologi tumbuhan ubatan.
Wort St. John (Hypericum perforatum L.), juga dikenali sebagai wort St. John, ialah tumbuhan herba saka daripada keluarga Hypericaceae yang mempunyai nilai ekonomi.[1] Komponen bioaktifnya yang berpotensi termasuk tanin semula jadi, xanton, floroglusinol, naftalendiantron (hiperin dan pseudohiperin), flavonoid, asid fenolik dan minyak pati.[2,3,4] Wort St. John boleh dibiakkan melalui kaedah tradisional; walau bagaimanapun, kaedah tradisional yang bermusim, percambahan biji benih yang rendah dan kerentanan terhadap penyakit mengehadkan potensinya untuk penanaman berskala besar dan pembentukan metabolit sekunder yang berterusan.[1,5,6]
Oleh itu, kultur tisu in vitro dianggap sebagai kaedah yang berkesan untuk pembiakan tumbuhan yang cepat, pemuliharaan sumber plasma nutfah, dan peningkatan hasil sebatian perubatan [7, 8]. Pengawal selia pertumbuhan tumbuhan (PGR) memainkan peranan penting dalam mengawal selia morfogenesis dan diperlukan untuk penanaman kalus dan seluruh organisma secara in vitro. Pengoptimuman kepekatan dan kombinasi mereka adalah penting untuk kejayaan proses perkembangan ini [9]. Oleh itu, memahami komposisi dan kepekatan pengatur yang sesuai adalah penting untuk meningkatkan pertumbuhan dan kapasiti regeneratif wort St. John (H. perforatum) [10].
Nanopartikel oksida besi (Fe₃O₄) ialah kelas nanopartikel yang telah atau sedang dibangunkan untuk kultur tisu. Fe₃O₄ mempunyai sifat magnet yang ketara, biokompatibiliti yang baik dan keupayaan untuk menggalakkan pertumbuhan tumbuhan dan mengurangkan tekanan persekitaran, jadi ia telah menarik perhatian yang besar dalam reka bentuk kultur tisu. Potensi aplikasi nanopartikel ini mungkin termasuk mengoptimumkan kultur in vitro untuk menggalakkan pembahagian sel, meningkatkan pengambilan nutrien dan mengaktifkan enzim antioksidan [11].
Walaupun nanopartikel telah menunjukkan kesan penggalak yang baik terhadap pertumbuhan tumbuhan, kajian mengenai aplikasi gabungan nanopartikel Fe₃O₄ dan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan yang dioptimumkan dalam *H. perforatum* masih terhad. Bagi mengisi jurang pengetahuan ini, kajian ini menilai kesan gabungan kesannya terhadap morfogenesis in vitro dan penghasilan metabolit sekunder untuk memberikan pandangan baharu bagi meningkatkan ciri-ciri tumbuhan ubatan. Oleh itu, kajian ini mempunyai dua objektif: (1) mengoptimumkan kepekatan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan untuk menggalakkan pembentukan kalus, pertumbuhan semula pucuk dan perakaran secara berkesan; dan (2) menilai kesan nanopartikel Fe₃O₄ terhadap parameter pertumbuhan secara in vitro. Rancangan masa hadapan termasuk menilai kadar kemandirian tumbuhan yang dijana semula semasa aklimatisasi (in vitro). Dijangkakan bahawa hasil kajian ini akan meningkatkan kecekapan mikropropagasi *H. perforatum* dengan ketara, sekali gus menyumbang kepada penggunaan mampan dan aplikasi bioteknologi tumbuhan ubatan penting ini.
Dalam kajian ini, kami memperoleh eksplan daun daripada tumbuhan St. John's wort tahunan yang ditanam di lapangan (tumbuhan induk). Eksplan ini digunakan untuk mengoptimumkan keadaan kultur in vitro. Sebelum dikultur, daun dibilas dengan teliti di bawah air suling yang mengalir selama beberapa minit. Permukaan eksplan kemudiannya dibasmi kuman dengan merendam dalam 70% etanol selama 30 saat, diikuti dengan merendam dalam larutan 1.5% natrium hipoklorit (NaOCl) yang mengandungi beberapa titis Tween 20 selama 10 minit. Akhir sekali, eksplan dibilas tiga kali dengan air suling steril sebelum dipindahkan ke medium kultur seterusnya.
Sepanjang empat minggu berikutnya, parameter pertumbuhan semula pucuk diukur, termasuk kadar pertumbuhan semula, bilangan pucuk setiap eksplan, dan panjang pucuk. Apabila pucuk yang dihasilkan semula mencapai panjang sekurang-kurangnya 2 cm, ia dipindahkan ke medium perakaran yang terdiri daripada medium MS separuh kekuatan, 0.5 mg/L asid indolebutirik (IBA), dan 0.3% gam guar. Kultur perakaran diteruskan selama tiga minggu, di mana kadar perakaran, bilangan akar, dan panjang akar diukur. Setiap rawatan diulang tiga kali, dengan 10 eksplan dikultur setiap replika, menghasilkan kira-kira 30 eksplan setiap rawatan.
Ketinggian tumbuhan diukur dalam sentimeter (cm) menggunakan pembaris, dari pangkal tumbuhan hingga ke hujung daun tertinggi. Panjang akar diukur dalam milimeter (mm) sejurus selepas anak benih dikeluarkan dengan teliti dan medium pertumbuhan dikeluarkan. Bilangan tunas setiap eksplan dikira secara langsung pada setiap tumbuhan. Bilangan bintik hitam pada daun, yang dikenali sebagai nodul, diukur secara visual. Nodul hitam ini dipercayai sebagai kelenjar yang mengandungi hiperisin, atau bintik oksidatif, dan digunakan sebagai penunjuk fisiologi tindak balas tumbuhan terhadap rawatan. Selepas mengeluarkan semua medium pertumbuhan, berat segar anak benih diukur menggunakan penimbang elektronik dengan ketepatan miligram (mg).
Kaedah untuk mengira kadar pembentukan kalus adalah seperti berikut: selepas mengkultur eksplan dalam medium yang mengandungi pelbagai pengawal selia pertumbuhan (kinase, 2,4-D, dan Fe3O4) selama empat minggu, bilangan eksplan yang mampu membentuk kalus dikira. Formula untuk mengira kadar pembentukan kalus adalah seperti berikut:
Setiap rawatan diulang tiga kali, dengan sekurang-kurangnya 10 eksplan diperiksa dalam setiap ulangan.
Kadar regenerasi mencerminkan perkadaran tisu kalus yang berjaya melengkapkan proses pembezaan tunas selepas peringkat pembentukan kalus. Penunjuk ini menunjukkan keupayaan tisu kalus untuk berubah menjadi tisu yang telah dibezakan dan tumbuh menjadi organ tumbuhan baharu.
Pekali perakaran ialah nisbah bilangan cabang yang mampu berakar kepada jumlah bilangan cabang. Penunjuk ini mencerminkan kejayaan peringkat perakaran, yang penting dalam pembiakan mikro dan pembiakan tumbuhan, kerana perakaran yang baik membantu anak benih hidup dengan lebih baik dalam keadaan pertumbuhan.
Sebatian hiperisin diekstrak dengan 90% metanol. Lima puluh mg bahan tumbuhan kering ditambah kepada 1 ml metanol dan disonikasi selama 20 minit pada 30 kHz dalam pembersih ultrasonik (model A5120-3YJ) pada suhu bilik dalam keadaan gelap. Selepas sonikasi, sampel disentrifugasi pada 6000 rpm selama 15 minit. Supernatan dikumpulkan, dan penyerapan hiperisin diukur pada 592 nm menggunakan spektrofotometer Plus-3000 S mengikut kaedah yang diterangkan oleh Conceiçao et al. [14].
Kebanyakan rawatan dengan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan (PGR) dan nanopartikel oksida besi (Fe₃O₄-NP) tidak mendorong pembentukan nodul hitam pada daun pucuk yang dijana semula. Tiada nodul diperhatikan dalam mana-mana rawatan dengan 0.5 atau 1 mg/L 2,4-D, 0.5 atau 1 mg/L kinetin, atau 1, 2, atau 4 mg/L nanopartikel oksida besi. Beberapa kombinasi menunjukkan sedikit peningkatan dalam perkembangan nodul (tetapi tidak signifikan secara statistik) pada kepekatan nanopartikel kinetin dan/atau oksida besi yang lebih tinggi, seperti gabungan 2,4-D (0.5–2 mg/L) dengan kinetin (1–1.5 mg/L) dan nanopartikel oksida besi (2–4 mg/L). Keputusan ini ditunjukkan dalam Rajah 2. Nodul hitam mewakili kelenjar kaya hiperisin, kedua-duanya berlaku secara semula jadi dan bermanfaat. Dalam kajian ini, nodul hitam terutamanya dikaitkan dengan pencoklatan tisu, menunjukkan persekitaran yang baik untuk pengumpulan hiperisin. Rawatan dengan nanopartikel 2,4-D, kinetin, dan Fe₃O₄ menggalakkan pertumbuhan kalus, mengurangkan pencoklatan, dan meningkatkan kandungan klorofil, menunjukkan fungsi metabolik yang lebih baik dan potensi pengurangan kerosakan oksidatif [37]. Kajian ini menilai kesan kinetin dalam kombinasi dengan nanopartikel 2,4-D dan Fe₃O₄ terhadap pertumbuhan dan perkembangan kalus wort St. John (Rajah 3a–g). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa nanopartikel Fe₃O₄ mempunyai aktiviti antikulat dan antimikrob [38, 39] dan, apabila digunakan dalam kombinasi dengan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan, boleh merangsang mekanisme pertahanan tumbuhan dan mengurangkan indeks tekanan selular [18]. Walaupun biosintesis metabolit sekunder dikawal secara genetik, hasil sebenar mereka sangat bergantung pada keadaan persekitaran. Perubahan metabolik dan morfologi boleh mempengaruhi tahap metabolit sekunder dengan mengawal selia ekspresi gen tumbuhan tertentu dan bertindak balas terhadap faktor persekitaran. Tambahan pula, pendorong boleh mencetuskan pengaktifan gen baharu, yang seterusnya merangsang aktiviti enzimatik, akhirnya mengaktifkan pelbagai laluan biosintetik dan membawa kepada pembentukan metabolit sekunder. Tambahan pula, satu lagi kajian menunjukkan bahawa mengurangkan teduhan meningkatkan pendedahan cahaya matahari, sekali gus meningkatkan suhu siang hari di habitat semula jadi *Hypericum perforatum*, yang turut menyumbang kepada peningkatan hasil hiperisin. Berdasarkan data ini, kajian ini mengkaji peranan nanopartikel besi sebagai pendorong berpotensi dalam kultur tisu. Keputusan menunjukkan bahawa nanopartikel ini boleh mengaktifkan gen yang terlibat dalam biosintesis hesperidin melalui rangsangan enzimatik, yang membawa kepada peningkatan pengumpulan sebatian ini (Rajah 2). Oleh itu, berbanding tumbuhan yang tumbuh di bawah keadaan semula jadi, boleh dikatakan bahawa penghasilan sebatian sedemikian secara in vivo juga boleh dipertingkatkan apabila tekanan sederhana digabungkan dengan pengaktifan gen yang terlibat dalam biosintesis metabolit sekunder. Rawatan kombinasi secara amnya mempunyai kesan positif terhadap kadar regenerasi, tetapi dalam beberapa kes, kesan ini menjadi lemah. Terutamanya, rawatan dengan 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinase, dan kepekatan yang berbeza boleh meningkatkan kadar regenerasi secara bebas dan ketara sebanyak 50.85% berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 4c). Keputusan ini menunjukkan bahawa kombinasi khusus nanohormon boleh bertindak secara sinergi untuk menggalakkan pertumbuhan tumbuhan dan penghasilan metabolit, yang sangat penting untuk kultur tisu tumbuhan ubatan. Palmer dan Keller [50] menunjukkan bahawa rawatan 2,4-D secara bebas boleh mendorong pembentukan kalus dalam St. perforatum, manakala penambahan kinase meningkatkan pembentukan dan regenerasi kalus dengan ketara. Kesan ini adalah disebabkan oleh peningkatan keseimbangan hormon dan rangsangan pembahagian sel. Bal et al. [51] mendapati bahawa rawatan Fe₃O₄-NP secara bebas boleh meningkatkan fungsi enzim antioksidan, sekali gus menggalakkan pertumbuhan akar dalam St. perforatum. Media kultur yang mengandungi nanopartikel Fe₃O₄ pada kepekatan 0.5 mg/L, 1 mg/L, dan 1.5 mg/L meningkatkan kadar pertumbuhan semula tumbuhan rami [52]. Penggunaan nanopartikel kinetin, 2,4-diklorobenzotiazolinon, dan Fe₃O₄ meningkatkan kadar pembentukan kalus dan akar dengan ketara, namun begitu, potensi kesan sampingan penggunaan hormon ini untuk pertumbuhan semula in vitro perlu dipertimbangkan. Contohnya, penggunaan 2,4-diklorobenzotiazolinon atau kinetin dalam jangka masa panjang atau kepekatan tinggi boleh mengakibatkan variasi klon somatik, tekanan oksidatif, morfologi kalus yang tidak normal, atau vitrifikasi. Oleh itu, kadar pertumbuhan semula yang tinggi tidak semestinya meramalkan kestabilan genetik. Semua tumbuhan yang dijana semula harus dinilai menggunakan penanda molekul (contohnya RAPD, ISSR, AFLP) atau analisis sitogenetik untuk menentukan homogeniti dan persamaannya dengan tumbuhan in vivo [53,54,55].
Kajian ini buat pertama kalinya menunjukkan bahawa penggunaan gabungan pengawal selia pertumbuhan tumbuhan (2,4-D dan kinetin) dengan nanopartikel Fe₃O₄ dapat meningkatkan morfogenesis dan pengumpulan metabolit bioaktif utama (termasuk hiperisin dan hiperosida) dalam *Hypericum perforatum*. Rejimen rawatan yang dioptimumkan (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) bukan sahaja memaksimumkan pembentukan kalus, organogenesis dan hasil metabolit sekunder tetapi juga menunjukkan kesan induksi ringan, yang berpotensi meningkatkan toleransi tekanan dan nilai perubatan tumbuhan. Gabungan nanoteknologi dan kultur tisu tumbuhan menyediakan platform yang mampan dan cekap untuk pengeluaran sebatian perubatan secara in vitro berskala besar. Keputusan ini membuka jalan untuk aplikasi perindustrian dan penyelidikan masa depan ke dalam mekanisme molekul, pengoptimuman dos dan ketepatan genetik, sekali gus menghubungkan penyelidikan asas mengenai tumbuhan ubatan dengan bioteknologi praktikal.
Masa siaran: 12 Dis-2025