Pertumbuhan meristem apikal pucuk (SAM) adalah penting untuk seni bina batang. Hormon tumbuhangiberelin(GA) memainkan peranan penting dalam menyelaraskan pertumbuhan tumbuhan, tetapi peranan mereka dalam SAM masih kurang difahami. Di sini, kami membangunkan biosensor nisbah bagi isyarat GA dengan merekayasa protein DELLA untuk menyekat fungsi pengawalseliaannya yang penting dalam tindak balas transkrip GA sambil mengekalkan kemerosotannya selepas pengiktirafan GA. Kami menunjukkan bahawa biosensor berasaskan degradasi ini merekodkan dengan tepat perubahan dalam tahap GA dan penderiaan selular semasa pembangunan. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan aktiviti isyarat GA dalam SAM. Kami menunjukkan bahawa isyarat GA yang tinggi terdapat terutamanya dalam sel yang terletak di antara primordia organ, yang merupakan prekursor kepada sel internode. Menggunakan pendekatan keuntungan dan kehilangan fungsi, kami selanjutnya menunjukkan bahawa GA mengawal orientasi satah pembahagian sel, mewujudkan organisasi selular kanonik internod, dengan itu mempromosikan spesifikasi internode dalam SAM.
Meristem apikal pucuk (SAM), yang terletak di puncak pucuk, mengandungi ceruk sel stem yang aktivitinya menghasilkan organ sisi dan nod batang secara modular dan berulang sepanjang hayat tumbuhan. Setiap unit berulang ini, atau nod tumbuhan, termasuk internod dan organ sisi pada nod, dan meristem axillary dalam axils daun1. Pertumbuhan dan organisasi nod tumbuhan berubah semasa pembangunan. Dalam Arabidopsis, pertumbuhan internodal ditindas semasa peringkat vegetatif, dan meristem axillary kekal tidak aktif di axils daun roset. Semasa peralihan kepada fasa bunga, SAM menjadi meristem perbungaan, menghasilkan ruas memanjang dan tunas ketiak, dahan kecil di axils daun kaulin, dan kemudiannya, bunga tanpa daun2. Walaupun kami telah mencapai kemajuan yang ketara dalam memahami mekanisme yang mengawal permulaan daun, bunga dan dahan, agak sedikit yang diketahui tentang cara internod timbul.
Memahami taburan spatiotemporal GA akan membantu memahami dengan lebih baik fungsi hormon ini dalam tisu yang berbeza dan pada peringkat perkembangan yang berbeza. Visualisasi kemerosotan gabungan RGA-GFP yang dinyatakan di bawah tindakan penganjurnya sendiri memberikan maklumat penting tentang peraturan jumlah tahap GA dalam akar15,16. Walau bagaimanapun, ekspresi RGA berbeza-beza merentas tisu17 dan dikawal oleh GA18. Oleh itu, ungkapan pembezaan promoter RGA boleh mengakibatkan corak pendarfluor diperhatikan dengan RGA-GFP dan dengan itu kaedah ini bukan kuantitatif. Baru-baru ini, GA19,20 berlabel bioaktif fluorescein (Fl) mendedahkan pengumpulan GA dalam endokorteks akar dan peraturan tahap selularnya oleh pengangkutan GA. Baru-baru ini, sensor GA FRET nlsGPS1 menunjukkan bahawa tahap GA berkorelasi dengan pemanjangan sel dalam akar, filamen dan hipokotil21 yang tumbuh gelap. Walau bagaimanapun, seperti yang telah kita lihat, kepekatan GA bukanlah satu-satunya parameter yang mengawal aktiviti isyarat GA, kerana ia bergantung pada proses penderiaan yang kompleks. Di sini, berdasarkan pemahaman kami tentang laluan isyarat DELLA dan GA, kami melaporkan pembangunan dan pencirian biosensor ratiometrik berasaskan degradasi untuk isyarat GA. Untuk membangunkan biosensor kuantitatif ini, kami menggunakan RGA sensitif GA mutan yang digabungkan dengan protein pendarfluor dan dinyatakan di mana-mana dalam tisu, serta protein pendarfluor yang tidak sensitif GA. Kami menunjukkan bahawa gabungan protein RGA mutan tidak mengganggu isyarat GA endogen apabila dinyatakan di mana-mana, dan biosensor ini boleh mengukur aktiviti isyarat yang terhasil daripada kedua-dua input GA dan pemprosesan isyarat GA oleh radas penderiaan dengan resolusi spatiotemporal yang tinggi. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan taburan spatiotemporal aktiviti isyarat GA dan mengukur cara GA mengawal tingkah laku selular dalam epidermis SAM. Kami menunjukkan bahawa GA mengawal orientasi satah pembahagian sel SAM yang terletak di antara primordia organ, dengan itu mentakrifkan organisasi selular kanonik internode.
Akhirnya, kami bertanya sama ada qmRGA boleh melaporkan perubahan dalam tahap GA endogen menggunakan hipokotil yang semakin meningkat. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa nitrat merangsang pertumbuhan dengan meningkatkan sintesis GA dan, seterusnya, degradasi DELLA34. Sehubungan itu, kami memerhatikan bahawa panjang hipokotil dalam anak pokok pUBQ10::qmRGA yang ditanam di bawah bekalan nitrat yang banyak (10 mM NO3−) adalah jauh lebih lama daripada anak benih yang ditanam dalam keadaan kekurangan nitrat (Tambahan Rajah 6a). Selaras dengan tindak balas pertumbuhan, isyarat GA adalah lebih tinggi dalam hipokotil anak benih yang ditanam di bawah keadaan 10 mM NO3− berbanding anak benih yang ditanam tanpa nitrat (Tambahan Rajah 6b, c). Oleh itu, qmRGA juga membolehkan pemantauan perubahan dalam isyarat GA yang disebabkan oleh perubahan endogen dalam kepekatan GA.
Untuk memahami sama ada aktiviti isyarat GA yang dikesan oleh qmRGA bergantung pada kepekatan GA dan persepsi GA, seperti yang dijangkakan berdasarkan reka bentuk sensor, kami menganalisis ekspresi tiga reseptor GID1 dalam tisu vegetatif dan pembiakan. Dalam anak benih, garis wartawan GID1-GUS menunjukkan bahawa GID1a dan c sangat dinyatakan dalam kotiledon (Rajah 3a-c). Di samping itu, ketiga-tiga reseptor dinyatakan dalam daun, primordia akar sisi, hujung akar (kecuali penutup akar GID1b), dan sistem vaskular (Rajah 3a–c). Dalam SAM inflorescence, kami mengesan isyarat GUS hanya untuk GID1b dan 1c (Tambahan Rajah 7a-c). Hibridisasi in situ mengesahkan corak ekspresi ini dan seterusnya menunjukkan bahawa GID1c dinyatakan secara seragam pada tahap rendah dalam SAM, manakala GID1b menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi di pinggir SAM (Tambahan Rajah 7d-l). Gabungan translasi pGID1b::2xmTQ2-GID1b juga mendedahkan julat gred ekspresi GID1b, daripada ekspresi rendah atau tiada di tengah SAM kepada ekspresi tinggi di sempadan organ (Tambahan Rajah 7m). Oleh itu, reseptor GID1 tidak diedarkan secara seragam ke seluruh dan dalam tisu. Dalam eksperimen seterusnya, kami juga mendapati bahawa ekspresi berlebihan GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) meningkatkan sensitiviti qmRGA dalam hipokotil kepada aplikasi GA luaran (Rajah 3d, e). Sebaliknya, pendarfluor yang diukur oleh qd17mRGA dalam hipokotil adalah tidak sensitif terhadap rawatan GA3 (Rajah 3f, g). Untuk kedua-dua ujian, anak benih dirawat dengan kepekatan tinggi GA (100 μM GA3) untuk menilai kelakuan pantas sensor, di mana keupayaan untuk mengikat kepada reseptor GID1 telah dipertingkatkan atau hilang. Bersama-sama, keputusan ini mengesahkan bahawa biosensor qmRGA berfungsi sebagai fungsi gabungan sebagai penderia GA dan GA, dan mencadangkan bahawa ekspresi pembezaan reseptor GID1 boleh memodulasi emisitiviti sensor dengan ketara.
Sehingga kini, pengedaran isyarat GA dalam SAM masih tidak jelas. Oleh itu, kami menggunakan tumbuhan pengekspresi qmRGA dan reporter sel stem pCLV3::mCherry-NLS35 untuk mengira peta kuantitatif resolusi tinggi aktiviti isyarat GA, memfokuskan pada lapisan L1 (epidermis; Rajah 4a, b, lihat Kaedah dan Kaedah Tambahan), memandangkan L1 memainkan peranan penting dalam mengawal pertumbuhan SAM36. Di sini, ungkapan pCLV3::mCherry-NLS menyediakan titik rujukan geometri tetap untuk menganalisis taburan spatiotemporal aktiviti isyarat GA37. Walaupun GA dianggap penting untuk perkembangan organ sisi4, kami mendapati bahawa isyarat GA adalah rendah dalam primordium bunga (P) bermula dari peringkat P3 (Rajah 4a, b), manakala primordium P1 dan P2 muda mempunyai aktiviti sederhana serupa dengan di kawasan tengah (Rajah 4a, b). Aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi dikesan pada sempadan primordium organ, bermula pada P1/P2 (di sisi sempadan) dan memuncak pada P4, serta dalam semua sel kawasan persisian yang terletak di antara primordia (Rajah 4a, b dan Rajah Tambahan 8a, b). Aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi ini diperhatikan bukan sahaja pada epidermis tetapi juga pada lapisan L2 dan L3 atas (Tambahan Rajah 8b). Corak isyarat GA yang dikesan dalam SAM menggunakan qmRGA juga kekal tidak berubah dari semasa ke semasa (Tambahan Rajah 8c–f, k). Walaupun konstruk qd17mRGA dikurangkan secara sistematik dalam SAM tumbuhan T3 daripada lima garis bebas yang kami cirikan secara terperinci, kami dapat menganalisis corak pendarfluor yang diperoleh dengan konstruk pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Tambahan Rajah 8g-j, l). Dalam garis kawalan ini, hanya perubahan kecil dalam nisbah pendarfluor yang dikesan dalam SAM, tetapi di pusat SAM kami melihat penurunan yang jelas dan tidak dijangka dalam VENUS yang dikaitkan dengan TagBFP. Ini mengesahkan bahawa corak isyarat yang diperhatikan oleh qmRGA mencerminkan kemerosotan yang bergantung kepada GA bagi mRGA-VENUS, tetapi juga menunjukkan bahawa qmRGA mungkin melebihkan aktiviti isyarat GA di pusat meristem. Ringkasnya, keputusan kami mendedahkan corak isyarat GA yang mencerminkan taburan primordia. Taburan rantau antara primordial (IPR) ini disebabkan oleh penubuhan secara beransur-ansur aktiviti isyarat GA yang tinggi antara primordium yang sedang membangun dan kawasan tengah, manakala pada masa yang sama aktiviti isyarat GA dalam primordium berkurangan (Rajah 4c, d).
Taburan reseptor GID1b dan GID1c (lihat di atas) menunjukkan bahawa ekspresi pembezaan reseptor GA membantu membentuk corak aktiviti isyarat GA dalam SAM. Kami tertanya-tanya sama ada pengumpulan pembezaan GA mungkin terlibat. Untuk menyiasat kemungkinan ini, kami menggunakan nlsGPS1 GA FRET sensor21. Peningkatan kekerapan pengaktifan dikesan dalam SAM nlsGPS1 yang dirawat dengan 10 μM GA4 + 7 selama 100 minit (Tambahan Rajah 9a-e), menunjukkan bahawa nlsGPS1 bertindak balas terhadap perubahan dalam kepekatan GA dalam SAM, seperti yang berlaku pada roots21. Taburan spatial bagi kekerapan pengaktifan nlsGPS1 mendedahkan paras GA yang agak rendah pada lapisan luar SAM, tetapi menunjukkan bahawa ia dinaikkan di tengah dan di sempadan SAM (Rajah 4e dan Rajah Tambahan 9a, c). Ini menunjukkan bahawa GA juga diedarkan dalam SAM dengan corak spatial yang setanding dengan yang didedahkan oleh qmRGA. Sebagai pendekatan pelengkap, kami juga menganggap SAM dengan GA pendarfluor (GA3-, GA4-, GA7-Fl) atau Fl sahaja sebagai kawalan negatif. Isyarat Fl diedarkan ke seluruh SAM, termasuk kawasan tengah dan primordium, walaupun pada keamatan yang lebih rendah (Rajah 4j dan Rajah Tambahan 10d). Sebaliknya, ketiga-tiga GA-Fl terkumpul secara khusus dalam sempadan primordium dan pada tahap yang berbeza-beza di seluruh IPR, dengan GA7-Fl terkumpul dalam domain terbesar dalam IPR (Rajah 4k dan Rajah Tambahan 10a, b). Kuantifikasi keamatan pendarfluor mendedahkan bahawa nisbah keamatan IPR kepada bukan IPR adalah lebih tinggi dalam SAM yang dirawat GA-Fl berbanding SAM yang dirawat Fl (Rajah 4l dan Rajah Tambahan 10c). Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa GA hadir pada kepekatan yang lebih tinggi dalam sel IPR yang terletak paling hampir dengan sempadan organ. Ini menunjukkan bahawa corak aktiviti isyarat SAM GA terhasil daripada kedua-dua ekspresi pembezaan reseptor GA dan pengumpulan pembezaan GA dalam sel IPR berhampiran sempadan organ. Oleh itu, analisis kami mendedahkan corak spatiotemporal GA yang tidak dijangka, dengan aktiviti yang lebih rendah di tengah dan primordium SAM dan aktiviti yang lebih tinggi dalam IPR di kawasan pinggir.
Untuk memahami peranan aktiviti isyarat GA pembezaan dalam SAM, kami menganalisis korelasi antara aktiviti isyarat GA, pengembangan sel dan pembahagian sel menggunakan pengimejan selang masa masa nyata SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Memandangkan peranan GA dalam peraturan pertumbuhan, korelasi positif dengan parameter pengembangan sel dijangkakan. Oleh itu, kami mula-mula membandingkan peta aktiviti isyarat GA dengan peta kadar pertumbuhan permukaan sel (sebagai proksi untuk kekuatan pengembangan sel untuk sel tertentu dan untuk sel anak pada pembahagian) dan dengan peta anisotropi pertumbuhan, yang mengukur arah pengembangan sel (juga digunakan di sini untuk sel tertentu dan untuk sel anak pada pembahagian; Rajah 5a, b, lihat Kaedah dan Kaedah Tambahan). Peta kadar pertumbuhan permukaan sel SAM kami adalah konsisten dengan pemerhatian sebelumnya38,39, dengan kadar pertumbuhan minimum di sempadan dan kadar pertumbuhan maksimum dalam mengembangkan bunga (Rajah 5a). Analisis komponen utama (PCA) menunjukkan bahawa aktiviti isyarat GA berkorelasi negatif dengan keamatan pertumbuhan permukaan sel (Rajah 5c). Kami juga menunjukkan bahawa paksi utama variasi, termasuk input isyarat GA dan intensiti pertumbuhan, adalah ortogon dengan arah yang ditentukan oleh ekspresi CLV3 yang tinggi, mengesahkan pengecualian sel dari pusat SAM dalam analisis yang tinggal. Analisis korelasi Spearman mengesahkan keputusan PCA (Rajah 5d), menunjukkan bahawa isyarat GA yang lebih tinggi dalam IPR tidak menghasilkan pengembangan sel yang lebih tinggi. Walau bagaimanapun, analisis korelasi mendedahkan korelasi positif yang sedikit antara aktiviti isyarat GA dan anisotropi pertumbuhan (Rajah 5c, d), menunjukkan bahawa isyarat GA yang lebih tinggi dalam IPR mempengaruhi arah pertumbuhan sel dan mungkin kedudukan satah pembahagian sel.
a, b Peta haba bagi pertumbuhan permukaan purata (a) dan anisotropi pertumbuhan (b) dalam SAM berpurata ke atas tujuh tumbuhan bebas (masing-masing digunakan sebagai proksi untuk kekuatan dan arah pengembangan sel). c Analisis PCA termasuk pembolehubah berikut: isyarat GA, keamatan pertumbuhan permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan dan ekspresi CLV3. Komponen PCA 1 terutamanya berkorelasi negatif dengan keamatan pertumbuhan permukaan dan berkorelasi positif dengan isyarat GA. Komponen PCA 2 terutamanya berkorelasi positif dengan anisotropi pertumbuhan permukaan dan berkorelasi negatif dengan ekspresi CLV3. Peratusan mewakili variasi yang dijelaskan oleh setiap komponen. d Analisis korelasi Spearman antara isyarat GA, keamatan pertumbuhan permukaan, dan anisotropi pertumbuhan permukaan pada skala tisu tidak termasuk CZ. Nombor di sebelah kanan ialah nilai Spearman rho antara dua pembolehubah. Asterisk menunjukkan kes di mana korelasi/korelasi negatif adalah sangat ketara. e Visualisasi 3D sel Col-0 SAM L1 dengan mikroskop confocal. Dinding sel baru yang terbentuk dalam SAM (tetapi bukan primordium) pada 10 jam diwarnakan mengikut nilai sudutnya. Bar warna ditunjukkan di sudut kanan bawah. Inset menunjukkan imej 3D yang sepadan pada 0 jam. Eksperimen diulang dua kali dengan keputusan yang sama. f Plot kotak memaparkan kadar pembahagian sel dalam IPR dan bukan IPR Col-0 SAM (n = 10 tumbuhan bebas). Garis tengah menunjukkan median, dan sempadan kotak menunjukkan persentil ke-25 dan ke-75. Misai menunjukkan nilai minimum dan maksimum yang ditentukan dengan perisian R. Nilai P diperoleh dengan ujian-t dua hujung Welch. g, h Gambarajah skematik menunjukkan (g) cara mengukur sudut dinding sel baharu (magenta) berkenaan dengan arah jejari dari pusat SAM (garis putus-putus putih) (hanya nilai sudut akut, iaitu, 0–90°, dipertimbangkan), dan (h) arah lilitan/sisi dan jejari dalam meristem. i Histogram kekerapan orientasi satah pembahagian sel merentasi SAM (biru tua), IPR (biru sederhana) dan bukan IPR (biru muda), masing-masing. Nilai P diperolehi dengan ujian Kolmogorov-Smirnov dua ekor. Eksperimen diulang dua kali dengan keputusan yang sama. j Histogram kekerapan orientasi satah pembahagian sel IPR di sekitar P3 (hijau muda), P4 (hijau sederhana), dan P5 (hijau gelap). Nilai P diperolehi dengan ujian Kolmogorov-Smirnov dua ekor. Eksperimen diulang dua kali dengan keputusan yang sama.
Oleh itu, kami seterusnya menyiasat korelasi antara isyarat GA dan aktiviti pembahagian sel dengan mengenal pasti dinding sel yang baru terbentuk semasa ujian (Rajah 5e). Pendekatan ini membolehkan kami mengukur kekerapan dan arah pembahagian sel. Yang menghairankan, kami mendapati bahawa kekerapan pembahagian sel dalam IPR dan seluruh SAM (bukan IPR, Rajah 5f) adalah serupa, menunjukkan bahawa perbezaan dalam isyarat GA antara sel IPR dan bukan IPR tidak menjejaskan pembahagian sel dengan ketara. Ini, dan korelasi positif antara isyarat GA dan anisotropi pertumbuhan, mendorong kami untuk mempertimbangkan sama ada aktiviti isyarat GA boleh mempengaruhi orientasi satah pembahagian sel. Kami mengukur orientasi dinding sel baru sebagai sudut akut berbanding dengan paksi jejarian yang menghubungkan pusat meristem dan pusat dinding sel baru (Rajah 5e-i) dan memerhatikan kecenderungan yang jelas untuk sel membahagi pada sudut hampir 90° berbanding paksi jejari, dengan frekuensi tertinggi diperhatikan pada 70°-80° dan 9°-80° (22.62%) (Rajah 5e,i), sepadan dengan pembahagian sel dalam arah lilitan / melintang (Rajah 5h). Untuk mengkaji sumbangan isyarat GA kepada tingkah laku pembahagian sel ini, kami menganalisis parameter pembahagian sel dalam IPR dan bukan IPR secara berasingan (Rajah 5i). Kami memerhatikan bahawa taburan sudut pembahagian dalam sel IPR berbeza daripada sel bukan IPR atau dalam sel dalam keseluruhan SAM, dengan sel IPR mempamerkan bahagian yang lebih tinggi bagi bahagian sel sisi/bulat, iaitu, 70–80° dan 80–90° (33.86% dan 30.71%, masing-masing, perkadaran yang sepadan) (Rajah 5). Oleh itu, pemerhatian kami mendedahkan perkaitan antara isyarat GA tinggi dan orientasi satah pembahagian sel yang dekat dengan arah lilitan, serupa dengan korelasi antara aktiviti isyarat GA dan anisotropi pertumbuhan (Rajah 5c, d). Untuk terus mewujudkan pemuliharaan spatial persatuan ini, kami mengukur orientasi satah bahagian dalam sel IPR yang mengelilingi primordium bermula dari P3, memandangkan aktiviti isyarat GA tertinggi dikesan di rantau ini bermula dari P4 (Rajah 4). Sudut pembahagian IPR sekitar P3 dan P4 tidak menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik, walaupun peningkatan kekerapan pembahagian sel sisi diperhatikan dalam IPR sekitar P4 (Rajah 5j). Walau bagaimanapun, dalam sel IPR di sekitar P5, perbezaan dalam orientasi satah pembahagian sel menjadi ketara secara statistik, dengan peningkatan mendadak dalam kekerapan pembahagian sel melintang (Rajah 5j). Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa isyarat GA boleh mengawal orientasi pembahagian sel dalam SAM, yang konsisten dengan laporan sebelumnya40, 41 bahawa isyarat GA yang tinggi boleh mendorong orientasi sisi pembahagian sel dalam IPR.
Adalah diramalkan bahawa sel-sel dalam IPR tidak akan dimasukkan ke dalam primordia tetapi sebaliknya ke dalam internodes2,42,43. Orientasi melintang pembahagian sel dalam IPR boleh mengakibatkan organisasi biasa baris membujur selari sel epidermis dalam internod. Pemerhatian kami yang diterangkan di atas menunjukkan bahawa isyarat GA mungkin memainkan peranan dalam proses ini dengan mengawal arah pembahagian sel.
Kehilangan fungsi beberapa gen DELLA mengakibatkan tindak balas GA konstitutif, dan mutan della boleh digunakan untuk menguji hipotesis ini44. Kami mula-mula menganalisis corak ekspresi lima gen DELLA dalam SAM. Gabungan transkrip garis GUS45 mendedahkan bahawa GAI, RGA, RGL1, dan RGL2 (pada tahap yang lebih rendah) dinyatakan dalam SAM (Tambahan Rajah 11a-d). Hibridisasi in situ seterusnya menunjukkan bahawa mRNA GAI terkumpul secara khusus dalam primordia dan bunga yang sedang berkembang (Tambahan Rajah 11e). MRNA RGL1 dan RGL3 dikesan di seluruh kanopi SAM dan dalam bunga yang lebih tua, manakala mRNA RGL2 lebih banyak di kawasan sempadan (Tambahan Rajah 11f–h). Pengimejan konfokal pRGL3 :: RGL3-GFP SAM mengesahkan ungkapan yang diperhatikan oleh hibridisasi in situ dan menunjukkan bahawa protein RGL3 terkumpul di bahagian tengah SAM (Tambahan Rajah 11i). Menggunakan garis pRGA :: GFP-RGA, kami juga mendapati bahawa protein RGA terkumpul dalam SAM, tetapi kelimpahannya berkurangan di sempadan bermula dari P4 (Tambahan Rajah 11j). Terutama, corak ekspresi RGL3 dan RGA adalah konsisten dengan aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi dalam IPR, seperti yang dikesan oleh qmRGA (Rajah 4). Selain itu, data ini menunjukkan bahawa semua DELLA dinyatakan dalam SAM dan ekspresi mereka secara kolektif merangkumi keseluruhan SAM.
Kami seterusnya menganalisis parameter pembahagian sel dalam SAM jenis liar (Ler, kawalan) dan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutan (Rajah 6a, b). Menariknya, kami melihat perubahan ketara secara statistik dalam taburan frekuensi sudut pembahagian sel dalam SAM mutan global della berbanding jenis liar (Rajah 6c). Perubahan dalam mutan global della ini disebabkan oleh peningkatan dalam kekerapan sudut 80–90° (34.71% berbanding 24.55%) dan, sedikit sebanyak, sudut 70–80° (23.78% berbanding 20.18%), iaitu sepadan dengan pembahagian sel melintang (Rajah 6c). Kekerapan pembahagian bukan melintang (0–60°) juga lebih rendah dalam mutan global della (Rajah 6c). Kekerapan pembahagian sel melintang meningkat dengan ketara dalam SAM mutan global della (Rajah 6b). Kekerapan pembahagian sel melintang dalam IPR juga lebih tinggi dalam mutan global della berbanding jenis liar (Rajah 6d). Di luar kawasan IPR, jenis liar mempunyai taburan sudut pembahagian sel yang lebih seragam, manakala mutan global della memilih bahagian tangen seperti IPR (Rajah 6e). Kami juga mengukur orientasi pembahagian sel dalam SAM ga2 oxidase (ga2ox) mutan kuintupel (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, dan ga2ox6-2), latar belakang mutan GA-tidak aktif di mana GA terkumpul. Selaras dengan peningkatan paras GA, SAM bagi perbungaan mutan ga2ox kuintupel adalah lebih besar daripada Col-0 (Tambahan Rajah 12a, b), dan berbanding dengan Col-0, SAM kuituple ga2ox menunjukkan taburan sudut pembahagian sel yang berbeza, dengan kekerapan sudut meningkat daripada 50°ing, pembahagian tambahan kepada 90°. 12a–c). Oleh itu, kami menunjukkan bahawa pengaktifan konstitutif isyarat GA dan pengumpulan GA mendorong pembahagian sel sisi dalam IPR dan seluruh SAM.
a, b Visualisasi 3D lapisan L1 Ler yang diwarnai PI (a) dan mutan della global (b) SAM menggunakan mikroskop confocal. Dinding sel baharu yang terbentuk dalam SAM (tetapi bukan primordium) dalam tempoh 10 jam ditunjukkan dan diwarnakan mengikut nilai sudutnya. Inset menunjukkan SAM pada 0 jam. Bar warna dipaparkan di sudut kanan bawah. Anak panah dalam (b) menunjukkan contoh fail sel sejajar dalam mutan della global. Eksperimen diulang dua kali dengan keputusan yang sama. ce perbandingan taburan kekerapan orientasi satah pembahagian sel dalam keseluruhan SAM (d), IPR (e), dan bukan IPR (f) antara Ler dan global della. Nilai P diperoleh menggunakan ujian Kolmogorov-Smirnov dua ekor. f, g Visualisasi 3D bagi imej confocal SAM berwarna PI bagi Col-0 (i) dan pCUC2::gai-1-VENUS (j) tumbuhan transgenik. Panel (a, b) menunjukkan dinding sel baru (tetapi bukan primordia) yang terbentuk dalam SAM dalam masa 10 jam. Eksperimen diulang dua kali dengan keputusan yang sama. h–j Perbandingan taburan kekerapan orientasi satah pembahagian sel yang terletak di seluruh SAM (h), IPR (i) dan bukan IPR (j) antara tumbuhan Col-0 dan pCUC2::gai-1-VENUS. Nilai P diperoleh menggunakan ujian Kolmogorov-Smirnov dua ekor.
Kami seterusnya menguji kesan menghalang isyarat GA secara khusus dalam IPR. Untuk tujuan ini, kami menggunakan promoter cotyledon cup 2 (CUC2) untuk memacu ekspresi protein gai-1 negatif dominan yang bergabung dengan VENUS (dalam baris pCUC2::gai-1-VENUS). Dalam SAM jenis liar, penganjur CUC2 memacu ekspresi kebanyakan IPR dalam SAM, termasuk sel sempadan, dari P4 dan seterusnya, dan ungkapan khusus yang serupa diperhatikan dalam tumbuhan pCUC2::gai-1-VENUS (lihat di bawah). Taburan sudut pembahagian sel merentasi SAM atau IPR tumbuhan pCUC2::gai-1-VENUS tidak jauh berbeza daripada jenis liar, walaupun secara tidak disangka-sangka kami mendapati bahawa sel tanpa IPR dalam tumbuhan ini dibahagikan pada frekuensi yang lebih tinggi iaitu 80-90° (Rajah 6f-j).
Telah dicadangkan bahawa arah pembahagian sel bergantung pada geometri SAM, khususnya tegasan tegangan yang dihasilkan oleh kelengkungan tisu46. Oleh itu, kami bertanya sama ada bentuk SAM telah diubah dalam mutan global della dan tumbuhan pCUC2::gai-1-VENUS. Seperti yang dilaporkan sebelum ini12, saiz SAM mutan global della lebih besar daripada jenis liar (Tambahan Rajah 13a, b, d). Hibridisasi in situ CLV3 dan RNA STM mengesahkan pengembangan meristem dalam mutan della dan seterusnya menunjukkan pengembangan sisi niche sel stem (Tambahan Rajah 13e, f, h, i). Walau bagaimanapun, kelengkungan SAM adalah serupa dalam kedua-dua genotip (Tambahan Rajah 13k, m, n, p). Kami melihat peningkatan yang sama dalam saiz dalam gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutan tanpa perubahan kelengkungan berbanding jenis liar (Tambahan Rajah 13c, d, g, j, l, o, p). Kekerapan orientasi pembahagian sel juga terjejas dalam mutan della quadruple, tetapi pada tahap yang lebih rendah daripada mutan monolitik della (Tambahan Rajah 12d–f). Kesan dos ini, bersama-sama dengan kekurangan kesan pada kelengkungan, mencadangkan bahawa baki aktiviti RGL3 dalam mutan Della quadruple mengehadkan perubahan dalam orientasi pembahagian sel yang disebabkan oleh kehilangan aktiviti DELLA dan bahawa perubahan dalam bahagian sel sisi berlaku sebagai tindak balas kepada perubahan dalam aktiviti isyarat GA dan bukannya perubahan dalam geometri SAM. Seperti yang diterangkan di atas, promoter CUC2 memacu ekspresi IPR dalam SAM bermula pada P4 (Tambahan Rajah 14a, b), dan sebaliknya, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM mempunyai saiz yang dikurangkan tetapi kelengkungan yang lebih tinggi (Tambahan Rajah 14c–h). Perubahan dalam morfologi pCUC2::gai-1-VENUS SAM ini boleh mengakibatkan taburan tegasan mekanikal yang berbeza berbanding jenis liar, di mana tegasan lilitan tinggi bermula pada jarak yang lebih pendek dari pusat SAM47. Sebagai alternatif, perubahan dalam morfologi pCUC2::gai-1-VENUS SAM mungkin disebabkan oleh perubahan dalam sifat mekanikal serantau yang disebabkan oleh ekspresi transgene48. Dalam kedua-dua kes, ini boleh mengimbangi sebahagian kesan perubahan dalam isyarat GA dengan meningkatkan kemungkinan sel akan membahagi dalam orientasi lilitan / melintang, menjelaskan pemerhatian kami.
Diambil bersama, data kami mengesahkan bahawa isyarat GA yang lebih tinggi memainkan peranan aktif dalam orientasi sisi satah pembahagian sel dalam IPR. Mereka juga menunjukkan bahawa kelengkungan meristem juga mempengaruhi orientasi satah pembahagian sel dalam IPR.
Orientasi melintang satah pembahagian dalam IPR, disebabkan oleh aktiviti isyarat GA yang tinggi, menunjukkan bahawa GA pra-menyusun fail sel jejari dalam epidermis dalam SAM untuk menentukan organisasi selular yang kemudiannya akan ditemui dalam internod epidermis. Sesungguhnya, fail sel sedemikian sering kelihatan dalam imej SAM bagi mutan global della (Rajah 6b). Oleh itu, untuk meneroka lebih lanjut fungsi perkembangan corak spatial GA isyarat dalam SAM, kami menggunakan pengimejan selang masa untuk menganalisis organisasi ruang sel dalam IPR dalam jenis liar (Ler dan Col-0), mutan global della, dan tumbuhan transgenik pCUC2:: gai-1-VENUS.
Kami mendapati bahawa qmRGA menunjukkan bahawa aktiviti isyarat GA dalam IPR meningkat daripada P1/P2 dan memuncak pada P4, dan corak ini kekal malar dari semasa ke semasa (Rajah 4a–f dan Rajah Tambahan 8c–f, k). Untuk menganalisis organisasi spatial sel dalam IPR dengan peningkatan isyarat GA, kami melabelkan sel IPR Ler di atas dan ke sisi P4 mengikut nasib perkembangan mereka yang dianalisis 34 jam selepas pemerhatian pertama, iaitu, lebih daripada dua kali plastid, membolehkan kami mengikuti sel IPR semasa pembangunan primordium dari P1 / P2 hingga P4. Kami menggunakan tiga warna berbeza: kuning untuk sel-sel yang disepadukan ke dalam primordium berhampiran P4, hijau untuk mereka yang berada dalam IPR, dan ungu untuk mereka yang mengambil bahagian dalam kedua-dua proses (Rajah 7a–c). Pada t0 (0 h), 1-2 lapisan sel IPR kelihatan di hadapan P4 (Rajah 7a). Seperti yang dijangkakan, apabila sel-sel ini dibahagikan, mereka melakukannya terutamanya melalui satah pembahagian melintang (Rajah 7a–c). Keputusan yang sama diperoleh menggunakan Col-0 SAM (memfokuskan pada P3, yang sempadannya dilipat sama dengan P4 dalam Ler), walaupun dalam genotip ini lipatan yang terbentuk di sempadan bunga menyembunyikan sel IPR dengan lebih cepat (Rajah 7g–i). Oleh itu, corak pembahagian sel IPR pra-menyusun sel ke dalam baris jejari, seperti dalam internod. Organisasi baris jejari dan penyetempatan sel IPR antara organ berturut-turut menunjukkan bahawa sel-sel ini adalah progenitor internodal.
Di sini, kami membangunkan biosensor isyarat GA ratiometrik, qmRGA, yang membolehkan pemetaan kuantitatif aktiviti isyarat GA yang terhasil daripada gabungan kepekatan reseptor GA dan GA sambil meminimumkan gangguan dengan laluan isyarat endogen, dengan itu memberikan maklumat tentang fungsi GA di peringkat selular. Untuk tujuan ini, kami membina protein DELLA yang diubah suai, mRGA, yang telah kehilangan keupayaan untuk mengikat rakan interaksi DELLA tetapi kekal sensitif terhadap proteolisis yang disebabkan oleh GA. qmRGA bertindak balas kepada kedua-dua perubahan eksogen dan endogen dalam tahap GA, dan sifat penderiaan dinamiknya membolehkan penilaian perubahan spatiotemporal dalam aktiviti isyarat GA semasa pembangunan. qmRGA juga merupakan alat yang sangat fleksibel kerana ia boleh disesuaikan dengan tisu yang berbeza dengan menukar promoter yang digunakan untuk ekspresinya (jika perlu), dan memandangkan sifat pemuliharaan laluan isyarat GA dan motif PFYRE merentas angiosperma, ia berkemungkinan boleh dipindahkan kepada spesies lain22. Selaras dengan ini, mutasi setara dalam protein SLR1 DELLA beras (HYY497AAA) juga ditunjukkan untuk menyekat aktiviti penindas pertumbuhan SLR1 sambil hanya mengurangkan sedikit kemerosotan pengantara GA, serupa dengan mRGA23. Terutama, kajian terbaru dalam Arabidopsis menunjukkan bahawa mutasi asid amino tunggal dalam domain PFYRE (S474L) mengubah aktiviti transkrip RGA tanpa menjejaskan keupayaannya untuk berinteraksi dengan rakan kongsi faktor transkripsi50. Walaupun mutasi ini sangat hampir dengan 3 penggantian asid amino yang terdapat dalam mRGA, kajian kami menunjukkan bahawa kedua-dua mutasi ini mengubah ciri-ciri berbeza DELLA. Walaupun kebanyakan rakan kongsi faktor transkripsi mengikat kepada domain LHR1 dan SAW DELLA26, 51, beberapa asid amino terpelihara dalam domain PFYRE boleh membantu menstabilkan interaksi ini.
Pembangunan internode adalah ciri utama dalam seni bina tumbuhan dan peningkatan hasil. qmRGA mendedahkan aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi dalam sel progenitor internode IPR. Dengan menggabungkan pengimejan kuantitatif dan genetik, kami menunjukkan bahawa corak isyarat GA menindih satah pembahagian sel bulat / melintang dalam epidermis SAM, membentuk organisasi pembahagian sel yang diperlukan untuk pembangunan internod. Beberapa pengawal selia orientasi satah pembahagian sel telah dikenal pasti semasa pembangunan52,53. Kerja kami memberikan contoh yang jelas tentang cara aktiviti isyarat GA mengawal parameter selular ini. DELLA boleh berinteraksi dengan kompleks protein pralipatan41, jadi isyarat GA boleh mengawal orientasi satah pembahagian sel dengan secara langsung mempengaruhi orientasi mikrotubulus kortikal40,41,54,55. Kami secara tidak dijangka menunjukkan bahawa dalam SAM, korelasi aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi bukanlah pemanjangan atau pembahagian sel, tetapi hanya anisotropi pertumbuhan, yang konsisten dengan kesan langsung GA terhadap arah pembahagian sel dalam IPR. Walau bagaimanapun, kita tidak boleh mengecualikan bahawa kesan ini juga mungkin tidak langsung, contohnya dimediasi oleh pelembutan dinding sel yang disebabkan oleh GA56. Perubahan dalam sifat dinding sel menyebabkan tekanan mekanikal57,58, yang juga boleh mempengaruhi orientasi satah pembahagian sel dengan menjejaskan orientasi mikrotubul kortikal39,46,59. Kesan gabungan tekanan mekanikal yang disebabkan oleh GA dan peraturan langsung orientasi microtubule oleh GA mungkin terlibat dalam menghasilkan corak tertentu orientasi pembahagian sel dalam IPR untuk menentukan internod, dan kajian lanjut diperlukan untuk menguji idea ini. Begitu juga, kajian terdahulu telah menekankan kepentingan protein berinteraksi DELLA TCP14 dan 15 dalam kawalan pembentukan internod60, 61 dan faktor-faktor ini boleh menjadi pengantara tindakan GA bersama-sama dengan BREVIPEDICELLUS (BP) dan PENNYWISE (PNY), yang mengawal perkembangan internode dan telah ditunjukkan mempengaruhi isyarat GA2, 62. Memandangkan DELLA berinteraksi dengan laluan isyarat brassinosteroid, etilena, asid jasmonik dan asid absisik (ABA)63,64 dan bahawa hormon ini boleh mempengaruhi orientasi mikrotubulus65, kesan GA pada orientasi pembahagian sel juga mungkin dimediasi oleh hormon lain.
Kajian sitologi awal menunjukkan bahawa kedua-dua kawasan dalam dan luar Arabidopsis SAM diperlukan untuk pembangunan internode2, 42. Fakta bahawa GA secara aktif mengawal pembahagian sel dalam tisu dalaman12 menyokong fungsi ganda GA dalam mengawal saiz meristem dan internod dalam SAM. Corak pembahagian sel berarah juga dikawal ketat dalam tisu SAM dalaman, dan peraturan ini penting untuk pertumbuhan batang52. Adalah menarik untuk mengkaji sama ada GA juga memainkan peranan dalam mengorientasikan satah pembahagian sel dalam organisasi SAM dalaman, dengan itu menyegerakkan spesifikasi dan pembangunan internod dalam SAM.
Tumbuhan ditanam secara in vitro dalam tanah atau 1x medium Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) ditambah dengan 1% sukrosa dan 1% agar (Sigma) di bawah keadaan standard (16 jam cahaya, 22 °C), kecuali untuk hipokotil dan eksperimen pertumbuhan akar di mana anak benih ditanam pada plat menegak di bawah cahaya malar dan 22 °C. Untuk eksperimen nitrat, tumbuhan ditanam pada medium MS yang diubah suai (medium tumbuhan bioWORLD) ditambah dengan nitrat yang mencukupi (0 atau 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa dan 1% A-agar (Sigma) dalam keadaan hari yang panjang.
GID1a cDNA yang dimasukkan ke dalam pDONR221 telah digabungkan semula dengan pDONR P4-P1R-pUBQ10 dan pDONR P2R-P3-mCherry ke dalam pB7m34GW untuk menghasilkan pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 yang dimasukkan ke dalam pDONR221 digabungkan semula ke dalam pB7RWG266 untuk menghasilkan p35S:IDD2-RFP. Untuk menjana pGID1b::2xmTQ2-GID1b, serpihan 3.9 kb hulu kawasan pengekodan GID1b dan serpihan 4.7 kb yang mengandungi cDNA GID1b (1.3 kb) dan terminator (3.4 kb) mula-mula dikuatkan menggunakan primer dalam pRDO PRMo Tambahan 3 dan kemudiannya dimasukkan ke dalam Jadual Tambahan PNR4 3. Fisher Scientific) dan pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), masing-masing, dan akhirnya digabungkan semula dengan pDONR221 2xmTQ268 ke dalam vektor sasaran pGreen 012567 menggunakan pengklonan Gateway. Untuk menjana pCUC2::LSSmOrange, jujukan promoter CUC2 (3229 bp hulu ATG) diikuti dengan jujukan pengekodan mOrange besar Stokes-shifted (LSSmOrange)69 dengan isyarat penyetempatan nuklear N7 dan penamat transkrip NOS telah dipasang ke dalam sistem penyasaran pGreen-refragment kanamycin gateway. (Invitrogen). Vektor binari tumbuhan telah dimasukkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 dan dimasukkan ke dalam daun Nicotiana benthamiana melalui kaedah penyusupan Agrobacterium dan ke dalam Arabidopsis thaliana Col-0 melalui kaedah celupan bunga, masing-masing. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry dan pCLV3::mCherry-NLS qmRGA telah diasingkan daripada keturunan F3 dan F1 bagi salib masing-masing.
Hibridisasi RNA in situ dilakukan pada hujung pucuk sepanjang kira-kira 1 cm72, yang dikumpul dan segera difikatkan dalam larutan FAA (3.7% formaldehid, 5% asid asetik, 50% etanol) yang telah disejukkan terlebih dahulu kepada 4 °C. Selepas 2 × 15 min rawatan vakum, fiksatif diubah dan sampel diinkubasi semalaman. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, dan RGL3 cDNA dan probe antisense kepada 3'-UTR mereka telah disintesis menggunakan primer yang ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 3 seperti yang diterangkan oleh Rosier et al.73. Probe berlabel digoxigenin telah dikesan secara imun menggunakan antibodi digoxigenin (pencairan 3000 kali ganda; Roche, nombor katalog: 11 093 274 910), dan bahagian telah diwarnai dengan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat (BCIP, 250-lipat nitroblutiontrafold)/BT0 pencairan) larutan.
Masa siaran: Feb-10-2025