Pertumbuhan meristem apikal pucuk (SAM) adalah penting untuk seni bina batang. Hormon tumbuhangiberelin(GA) memainkan peranan penting dalam menyelaraskan pertumbuhan tumbuhan, tetapi peranannya dalam SAM masih kurang difahami. Di sini, kami membangunkan biosensor nisbahmetrik isyarat GA dengan merekayasa protein DELLA untuk menyekat fungsi pengawalseliaan pentingnya dalam tindak balas transkripsi GA sambil mengekalkan degradasinya semasa pengecaman GA. Kami menunjukkan bahawa biosensor berasaskan degradasi ini merekodkan perubahan dalam tahap GA dan pengesanan selular dengan tepat semasa pembangunan. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan aktiviti isyarat GA dalam SAM. Kami menunjukkan bahawa isyarat GA yang tinggi terdapat terutamanya dalam sel yang terletak di antara primordia organ, yang merupakan prekursor kepada sel internod. Menggunakan pendekatan penambahan dan kehilangan fungsi, kami selanjutnya menunjukkan bahawa GA mengawal orientasi satah pembahagian sel, mewujudkan organisasi selular kanonik internod, sekali gus menggalakkan spesifikasi internod dalam SAM.
Meristem apikal pucuk (SAM), yang terletak di puncak pucuk, mengandungi niche sel stem yang aktivitinya menghasilkan organ lateral dan nod batang secara modular dan iteratif sepanjang hayat tumbuhan. Setiap unit berulang ini, atau nod tumbuhan, merangkumi ruas dan organ lateral pada nod, dan meristem aksila dalam ketiak daun1. Pertumbuhan dan organisasi nod tumbuhan berubah semasa perkembangan. Dalam Arabidopsis, pertumbuhan ruas disekat semasa peringkat vegetatif, dan meristem aksila kekal tidak aktif dalam ketiak daun roset. Semasa peralihan ke fasa bunga, SAM menjadi meristem perbungaan, menghasilkan ruas dan tunas aksila yang memanjang, ranting kecil dalam ketiak daun kaulin, dan kemudian, bunga tanpa daun2. Walaupun kita telah mencapai kemajuan yang ketara dalam memahami mekanisme yang mengawal permulaan daun, bunga, dan dahan, agak sedikit yang diketahui tentang bagaimana ruas timbul.
Memahami taburan spatiotemporal GA akan membantu untuk lebih memahami fungsi hormon ini dalam tisu yang berbeza dan pada peringkat perkembangan yang berbeza. Visualisasi degradasi gabungan RGA-GFP yang diekspresikan di bawah tindakan promoternya sendiri memberikan maklumat penting tentang pengawalaturan jumlah tahap GA dalam akar15,16. Walau bagaimanapun, ekspresi RGA berbeza-beza merentasi tisu17 dan dikawal selia oleh GA18. Oleh itu, ekspresi berbeza promoter RGA boleh mengakibatkan corak pendarfluor yang diperhatikan dengan RGA-GFP dan oleh itu kaedah ini tidak kuantitatif. Baru-baru ini, bioaktif fluorescein (Fl) berlabel GA19,20 mendedahkan pengumpulan GA dalam endokorteks akar dan pengawalaturan tahap selularnya melalui pengangkutan GA. Baru-baru ini, sensor GA FRET nlsGPS1 menunjukkan bahawa tahap GA berkorelasi dengan pemanjangan sel dalam akar, filamen dan hipokotil yang tumbuh gelap21. Walau bagaimanapun, seperti yang telah kita lihat, kepekatan GA bukanlah satu-satunya parameter yang mengawal aktiviti isyarat GA, kerana ia bergantung pada proses penderiaan yang kompleks. Di sini, berdasarkan pemahaman kami tentang laluan isyarat DELLA dan GA, kami melaporkan perkembangan dan pencirian biosensor nisbah berasaskan degradasi untuk isyarat GA. Untuk membangunkan biosensor kuantitatif ini, kami menggunakan RGA sensitif GA mutan yang digabungkan dengan protein pendarfluor dan diekspresikan secara meluas dalam tisu, serta protein pendarfluor yang tidak sensitif GA. Kami menunjukkan bahawa gabungan protein RGA mutan tidak mengganggu isyarat GA endogen apabila diekspresikan secara meluas, dan biosensor ini boleh mengukur aktiviti isyarat yang terhasil daripada input GA dan pemprosesan isyarat GA oleh radas penderia dengan resolusi spatiotemporal yang tinggi. Kami menggunakan biosensor ini untuk memetakan taburan spatiotemporal aktiviti isyarat GA dan mengukur bagaimana GA mengawal selia tingkah laku selular dalam epidermis SAM. Kami menunjukkan bahawa GA mengawal selia orientasi satah pembahagian sel SAM yang terletak di antara primordia organ, dengan itu menentukan organisasi selular kanonik internod.
Akhir sekali, kami bertanya sama ada qmRGA boleh melaporkan perubahan dalam tahap GA endogen menggunakan hipokotil yang sedang membesar. Sebelum ini, kami menunjukkan bahawa nitrat merangsang pertumbuhan dengan meningkatkan sintesis GA dan, seterusnya, degradasi DELLA34. Sehubungan itu, kami mendapati bahawa panjang hipokotil dalam anak benih pUBQ10::qmRGA yang ditanam di bawah bekalan nitrat yang banyak (10 mM NO3−) adalah jauh lebih panjang daripada anak benih yang ditanam di bawah keadaan kekurangan nitrat (Rajah Tambahan 6a). Selaras dengan tindak balas pertumbuhan, isyarat GA adalah lebih tinggi dalam hipokotil anak benih yang ditanam di bawah keadaan 10 mM NO3− berbanding anak benih yang ditanam tanpa nitrat (Rajah Tambahan 6b, c). Oleh itu, qmRGA juga membolehkan pemantauan perubahan dalam isyarat GA yang disebabkan oleh perubahan endogen dalam kepekatan GA.
Untuk memahami sama ada aktiviti isyarat GA yang dikesan oleh qmRGA bergantung pada kepekatan GA dan persepsi GA, seperti yang dijangkakan berdasarkan reka bentuk sensor, kami menganalisis ekspresi tiga reseptor GID1 dalam tisu vegetatif dan reproduktif. Dalam anak benih, garisan wartawan GID1-GUS menunjukkan bahawa GID1a dan c diekspresikan dengan tinggi dalam kotiledon (Rajah 3a–c). Di samping itu, ketiga-tiga reseptor diekspresikan dalam daun, primordia akar lateral, hujung akar (kecuali tudung akar GID1b), dan sistem vaskular (Rajah 3a–c). Dalam SAM perbungaan, kami mengesan isyarat GUS hanya untuk GID1b dan 1c (Rajah Tambahan 7a–c). Hibridisasi in situ mengesahkan corak ekspresi ini dan selanjutnya menunjukkan bahawa GID1c diekspresikan secara seragam pada tahap rendah dalam SAM, manakala GID1b menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi di pinggir SAM (Rajah Tambahan 7d–l). Gabungan translasi pGID1b::2xmTQ2-GID1b juga mendedahkan julat ekspresi GID1b yang dinilai, daripada ekspresi rendah atau tiada ekspresi di tengah SAM kepada ekspresi tinggi di sempadan organ (Rajah Tambahan 7m). Oleh itu, reseptor GID1 tidak diagihkan secara seragam merentasi dan di dalam tisu. Dalam eksperimen berikutnya, kami juga memerhatikan bahawa ekspresi berlebihan GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) meningkatkan kepekaan qmRGA dalam hipokotil kepada aplikasi GA luaran (Rajah 3d, e). Sebaliknya, pendarfluor yang diukur oleh qd17mRGA dalam hipokotil adalah tidak sensitif terhadap rawatan GA3 (Rajah 3f, g). Bagi kedua-dua ujian, anak benih dirawat dengan kepekatan GA yang tinggi (100 μM GA3) untuk menilai tingkah laku pantas sensor, di mana keupayaan untuk mengikat pada reseptor GID1 dipertingkatkan atau hilang. Secara keseluruhannya, keputusan ini mengesahkan bahawa biosensor qmRGA berfungsi sebagai fungsi gabungan sebagai sensor GA dan GA, dan menunjukkan bahawa ekspresi pembezaan reseptor GID1 dapat memodulasi emisiviti sensor dengan ketara.
Sehingga kini, taburan isyarat GA dalam SAM masih tidak jelas. Oleh itu, kami menggunakan tumbuhan yang mengekspresikan qmRGA dan pelapor sel stem pCLV3::mCherry-NLS35 untuk mengira peta kuantitatif resolusi tinggi bagi aktiviti isyarat GA, dengan memberi tumpuan kepada lapisan L1 (epidermis; Rajah 4a, b, lihat Kaedah dan Kaedah Tambahan), memandangkan L1 memainkan peranan penting dalam mengawal pertumbuhan SAM36. Di sini, ekspresi pCLV3::mCherry-NLS menyediakan titik rujukan geometri tetap untuk menganalisis taburan spatiotemporal aktiviti isyarat GA37. Walaupun GA dianggap penting untuk perkembangan organ lateral4, kami mendapati bahawa isyarat GA adalah rendah dalam primordium bunga (P) bermula dari peringkat P3 (Rajah 4a, b), manakala primordium P1 dan P2 muda mempunyai aktiviti sederhana yang serupa dengan yang terdapat di kawasan tengah (Rajah 4a, b). Aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi dikesan di sempadan primordium organ, bermula pada P1/P2 (di sisi sempadan) dan memuncak pada P4, serta di semua sel kawasan periferi yang terletak di antara primordia (Rajah 4a, b dan Rajah Tambahan 8a, b). Aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi ini diperhatikan bukan sahaja di epidermis tetapi juga di lapisan L2 dan L3 atas (Rajah Tambahan 8b). Corak isyarat GA yang dikesan dalam SAM menggunakan qmRGA juga kekal tidak berubah dari semasa ke semasa (Rajah Tambahan 8c–f, k). Walaupun konstruk qd17mRGA dikawal selia secara sistematik dalam SAM tumbuhan T3 daripada lima garisan bebas yang kami cirikan secara terperinci, kami dapat menganalisis corak pendarfluor yang diperoleh dengan konstruk pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Rajah Tambahan 8g–j, l). Dalam garisan kawalan ini, hanya perubahan kecil dalam nisbah pendarfluor dikesan dalam SAM, tetapi di pusat SAM kami memerhatikan penurunan VENUS yang jelas dan tidak dijangka yang berkaitan dengan TagBFP. Ini mengesahkan bahawa corak isyarat yang diperhatikan oleh qmRGA mencerminkan degradasi mRGA-VENUS yang bergantung kepada GA, tetapi juga menunjukkan bahawa qmRGA mungkin terlalu menganggarkan aktiviti isyarat GA di pusat meristem. Secara ringkasnya, keputusan kami mendedahkan corak isyarat GA yang terutamanya mencerminkan taburan primordia. Taburan kawasan antara primordial (IPR) ini adalah disebabkan oleh pembentukan aktiviti isyarat GA yang tinggi secara beransur-ansur antara primordium yang sedang berkembang dan kawasan tengah, manakala pada masa yang sama aktiviti isyarat GA di primordium berkurangan (Rajah 4c, d).
Taburan reseptor GID1b dan GID1c (lihat di atas) menunjukkan bahawa ekspresi berbeza reseptor GA membantu membentuk corak aktiviti isyarat GA dalam SAM. Kami tertanya-tanya sama ada pengumpulan berbeza GA mungkin terlibat. Untuk menyiasat kemungkinan ini, kami menggunakan sensor nlsGPS1 GA FRET21. Peningkatan frekuensi pengaktifan dikesan dalam SAM nlsGPS1 yang dirawat dengan 10 μM GA4+7 selama 100 minit (Rajah Tambahan 9a–e), menunjukkan bahawa nlsGPS1 bertindak balas terhadap perubahan kepekatan GA dalam SAM, seperti yang berlaku dalam akar21. Taburan ruang frekuensi pengaktifan nlsGPS1 mendedahkan tahap GA yang agak rendah dalam lapisan luar SAM, tetapi menunjukkan bahawa ia dinaikkan di tengah dan di sempadan SAM (Rajah 4e dan Rajah Tambahan 9a,c). Ini menunjukkan bahawa GA juga diedarkan dalam SAM dengan corak ruang yang setanding dengan yang didedahkan oleh qmRGA. Sebagai pendekatan pelengkap, kami juga merawat SAM dengan GA pendarfluor (GA3-, GA4-, GA7-Fl) atau Fl sahaja sebagai kawalan negatif. Isyarat Fl diedarkan ke seluruh SAM, termasuk kawasan tengah dan primordium, walaupun pada keamatan yang lebih rendah (Rajah 4j dan Rajah Tambahan 10d). Sebaliknya, ketiga-tiga GA-Fl terkumpul secara khusus di dalam sempadan primordium dan pada tahap yang berbeza-beza di seluruh IPR, dengan GA7-Fl terkumpul di domain terbesar dalam IPR (Rajah 4k dan Rajah Tambahan 10a,b). Kuantifikasi keamatan pendarfluor mendedahkan bahawa nisbah keamatan IPR kepada bukan IPR adalah lebih tinggi dalam SAM yang dirawat GA-Fl berbanding SAM yang dirawat Fl (Rajah 4l dan Rajah Tambahan 10c). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa GA hadir pada kepekatan yang lebih tinggi dalam sel IPR yang terletak paling dekat dengan sempadan organ. Ini menunjukkan bahawa corak aktiviti isyarat SAM GA terhasil daripada kedua-dua ekspresi berbeza reseptor GA dan pengumpulan berbeza GA dalam sel IPR berhampiran sempadan organ. Oleh itu, analisis kami mendedahkan corak spatiotemporal isyarat GA yang tidak dijangka, dengan aktiviti yang lebih rendah di tengah dan primordium SAM dan aktiviti yang lebih tinggi dalam IP R di kawasan periferi.
Untuk memahami peranan aktiviti isyarat GA yang berbeza dalam SAM, kami menganalisis korelasi antara aktiviti isyarat GA, pengembangan sel, dan pembahagian sel menggunakan pengimejan selang masa masa nyata SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Memandangkan peranan GA dalam pengawalaturan pertumbuhan, korelasi positif dengan parameter pengembangan sel dijangkakan. Oleh itu, kami terlebih dahulu membandingkan peta aktiviti isyarat GA dengan peta kadar pertumbuhan permukaan sel (sebagai proksi untuk kekuatan pengembangan sel untuk sel tertentu dan untuk sel anak semasa pembahagian) dan dengan peta anisotropi pertumbuhan, yang mengukur arah pengembangan sel (juga digunakan di sini untuk sel tertentu dan untuk sel anak semasa pembahagian; Rajah 5a,b, lihat Kaedah dan Kaedah Tambahan). Peta kadar pertumbuhan permukaan sel SAM kami adalah konsisten dengan pemerhatian sebelumnya38,39, dengan kadar pertumbuhan minimum di sempadan dan kadar pertumbuhan maksimum dalam bunga yang sedang berkembang (Rajah 5a). Analisis komponen utama (PCA) menunjukkan bahawa aktiviti isyarat GA berkorelasi negatif dengan keamatan pertumbuhan permukaan sel (Rajah 5c). Kami juga menunjukkan bahawa paksi variasi utama, termasuk input isyarat GA dan keamatan pertumbuhan, adalah ortogonal kepada arah yang ditentukan oleh ekspresi CLV3 yang tinggi, mengesahkan pengecualian sel daripada pusat SAM dalam analisis yang selebihnya. Analisis korelasi Spearman mengesahkan keputusan PCA (Rajah 5d), menunjukkan bahawa isyarat GA yang lebih tinggi dalam IP R tidak menghasilkan pengembangan sel yang lebih tinggi. Walau bagaimanapun, analisis korelasi mendedahkan korelasi positif yang sedikit antara aktiviti isyarat GA dan anisotropi pertumbuhan (Rajah 5c, d), menunjukkan bahawa isyarat GA yang lebih tinggi dalam IP R mempengaruhi arah pertumbuhan sel dan mungkin kedudukan satah pembahagian sel.
a, b Peta haba purata pertumbuhan permukaan (a) dan anisotropi pertumbuhan (b) dalam SAM dirata-ratakan ke atas tujuh tumbuhan bebas (masing-masing digunakan sebagai proksi untuk kekuatan dan arah pengembangan sel). c Analisis PCA merangkumi pembolehubah berikut: isyarat GA, keamatan pertumbuhan permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan dan ekspresi CLV3. Komponen PCA 1 terutamanya berkorelasi negatif dengan keamatan pertumbuhan permukaan dan berkorelasi positif dengan isyarat GA. Komponen PCA 2 terutamanya berkorelasi positif dengan anisotropi pertumbuhan permukaan dan berkorelasi negatif dengan ekspresi CLV3. Peratusan mewakili variasi yang dijelaskan oleh setiap komponen. d Analisis korelasi Spearman antara isyarat GA, keamatan pertumbuhan permukaan dan anisotropi pertumbuhan permukaan pada skala tisu tidak termasuk CZ. Nombor di sebelah kanan ialah nilai rho Spearman antara dua pembolehubah. Asterisk menunjukkan kes di mana korelasi/korelasi negatif sangat ketara. e Visualisasi 3D sel Col-0 SAM L1 melalui mikroskopi konfokal. Dinding sel baharu yang terbentuk dalam SAM (tetapi bukan primordium) pada 10 jam diwarnakan mengikut nilai sudutnya. Bar warna ditunjukkan di sudut kanan bawah. Sisipan menunjukkan imej 3D yang sepadan pada 0 jam. Eksperimen diulang dua kali dengan hasil yang serupa. f Plot kotak memaparkan kadar pembahagian sel dalam IPR dan bukan IPR Col-0 SAM (n = 10 tumbuhan bebas). Garis tengah menunjukkan median, dan sempadan kotak menunjukkan persentil ke-25 dan ke-75. Misai menunjukkan nilai minimum dan maksimum yang ditentukan dengan perisian R. Nilai P diperoleh dengan ujian-t dua hujung Welch. g, h Gambarajah skematik yang menunjukkan (g) cara mengukur sudut dinding sel baharu (magenta) berkenaan dengan arah jejari dari pusat SAM (garis putus-putus putih) (hanya nilai sudut lancip, iaitu, 0–90°, dipertimbangkan), dan (h) arah lilitan/sisi dan jejari dalam meristem. i Histogram frekuensi orientasi satah pembahagian sel merentasi SAM (biru gelap), IPR (biru sederhana), dan bukan IPR (biru muda), masing-masing. Nilai P diperoleh melalui ujian Kolmogorov-Smirnov dua hujung. Eksperimen ini diulang dua kali dengan hasil yang serupa. j Histogram frekuensi orientasi satah pembahagian sel IPR masing-masing di sekitar P3 (hijau muda), P4 (hijau sederhana), dan P5 (hijau gelap). Nilai P diperoleh melalui ujian Kolmogorov-Smirnov dua hujung. Eksperimen ini diulang dua kali dengan hasil yang serupa.
Oleh itu, kami seterusnya mengkaji korelasi antara isyarat GA dan aktiviti pembahagian sel dengan mengenal pasti dinding sel yang baru terbentuk semasa ujian (Rajah 5e). Pendekatan ini membolehkan kami mengukur frekuensi dan arah pembahagian sel. Secara mengejutkan, kami mendapati bahawa kekerapan pembahagian sel dalam IPR dan seluruh SAM (bukan IPR, Rajah 5f) adalah serupa, menunjukkan bahawa perbezaan dalam isyarat GA antara sel IPR dan bukan IPR tidak mempengaruhi pembahagian sel dengan ketara. Ini, dan korelasi positif antara isyarat GA dan anisotropi pertumbuhan, mendorong kami untuk mempertimbangkan sama ada aktiviti isyarat GA boleh mempengaruhi orientasi satah pembahagian sel. Kami mengukur orientasi dinding sel baharu sebagai sudut lancip relatif kepada paksi jejari yang menghubungkan pusat meristem dan pusat dinding sel baharu (Rajah 5e-i) dan memerhatikan kecenderungan yang jelas untuk sel membahagi pada sudut hampir 90° relatif kepada paksi jejari, dengan frekuensi tertinggi diperhatikan pada 70–80° (23.28%) dan 80–90° (22.62%) (Rajah 5e,i), sepadan dengan pembahagian sel dalam arah lilitan/melintang (Rajah 5h). Untuk mengkaji sumbangan isyarat GA kepada tingkah laku pembahagian sel ini, kami menganalisis parameter pembahagian sel dalam IP R dan bukan IP R secara berasingan (Rajah 5i). Kami mendapati bahawa taburan sudut pembahagian dalam sel IP R berbeza daripada sel bukan IP R atau dalam sel dalam keseluruhan SAM, dengan sel IP R mempamerkan perkadaran pembahagian sel lateral/bulat yang lebih tinggi, iaitu, 70–80° dan 80–90° (masing-masing 33.86% dan 30.71%, perkadaran yang sepadan) (Rajah 5i). Oleh itu, pemerhatian kami mendedahkan hubungan antara isyarat GA yang tinggi dan orientasi satah pembahagian sel yang hampir dengan arah lilitan, sama seperti korelasi antara aktiviti isyarat GA dan anisotropi pertumbuhan (Rajah 5c, d). Untuk menentukan lagi pemuliharaan ruang bagi hubungan ini, kami mengukur orientasi satah pembahagian dalam sel IP R yang mengelilingi primordium bermula dari P3, kerana aktiviti isyarat GA tertinggi dikesan di rantau ini bermula dari P4 (Rajah 4). Sudut pembahagian IP R di sekitar P3 dan P4 tidak menunjukkan perbezaan yang ketara secara statistik, walaupun peningkatan kekerapan pembahagian sel lateral diperhatikan dalam IP R di sekitar P4 (Rajah 5j). Walau bagaimanapun, dalam sel IP R di sekitar P5, perbezaan orientasi satah pembahagian sel menjadi signifikan secara statistik, dengan peningkatan mendadak dalam kekerapan pembahagian sel melintang (Rajah 5j). Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa isyarat GA boleh mengawal orientasi pembahagian sel dalam SAM, yang selaras dengan laporan sebelumnya40,41 bahawa isyarat GA yang tinggi boleh mendorong orientasi lateral pembahagian sel dalam IP R.
Diramalkan bahawa sel-sel dalam IP R tidak akan digabungkan ke dalam primordia tetapi sebaliknya ke dalam internod2,42,43. Orientasi melintang pembahagian sel dalam IP R boleh mengakibatkan organisasi tipikal baris membujur selari selari dalam internod. Pemerhatian kami yang diterangkan di atas menunjukkan bahawa isyarat GA mungkin memainkan peranan dalam proses ini dengan mengawal arah pembahagian sel.
Kehilangan fungsi beberapa gen DELLA mengakibatkan tindak balas GA yang konstitutif, dan mutan della boleh digunakan untuk menguji hipotesis ini44. Kami mula-mula menganalisis corak ekspresi lima gen DELLA dalam SAM. Gabungan transkripsi garis GUS45 mendedahkan bahawa GAI, RGA, RGL1, dan RGL2 (pada tahap yang jauh lebih rendah) diekspresikan dalam SAM (Rajah Tambahan 11a–d). Hibridisasi in situ selanjutnya menunjukkan bahawa mRNA GAI terkumpul secara khusus dalam primordia dan bunga yang sedang berkembang (Rajah Tambahan 11e). MRNA RGL1 dan RGL3 dikesan di seluruh kanopi SAM dan pada bunga yang lebih tua, manakala mRNA RGL2 lebih banyak di kawasan sempadan (Rajah Tambahan 11f–h). Pengimejan confocal pRGL3::RGL3-GFP SAM mengesahkan ekspresi yang diperhatikan oleh hibridisasi in situ dan menunjukkan bahawa protein RGL3 terkumpul di bahagian tengah SAM (Rajah Tambahan 11i). Menggunakan garisan pRGA::GFP-RGA, kami juga mendapati bahawa protein RGA terkumpul dalam SAM, tetapi kelimpahannya berkurangan di sempadan bermula dari P4 (Rajah Tambahan 11j). Terutamanya, corak ekspresi RGL3 dan RGA adalah konsisten dengan aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi dalam IPR, seperti yang dikesan oleh qmRGA (Rajah 4). Selain itu, data ini menunjukkan bahawa semua DELLA diekspresikan dalam SAM dan ekspresi mereka secara kolektif merangkumi seluruh SAM.
Seterusnya, kami menganalisis parameter pembahagian sel dalam SAM jenis liar (Ler, kawalan) dan mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Rajah 6a, b). Menariknya, kami memerhatikan perubahan statistik yang ketara dalam taburan frekuensi sudut pembahagian sel dalam SAM mutan della global berbanding dengan jenis liar (Rajah 6c). Perubahan dalam mutan della global ini adalah disebabkan oleh peningkatan frekuensi sudut 80–90° (34.71% vs. 24.55%) dan, pada tahap yang lebih rendah, sudut 70–80° (23.78% vs. 20.18%), iaitu, sepadan dengan pembahagian sel melintang (Rajah 6c). Kekerapan pembahagian bukan melintang (0–60°) juga lebih rendah dalam mutan della global (Rajah 6c). Kekerapan pembahagian sel melintang meningkat dengan ketara dalam SAM mutan della global (Rajah 6b). Kekerapan pembahagian sel melintang dalam IP R juga lebih tinggi dalam mutan della global berbanding jenis liar (Rajah 6d). Di luar kawasan IP R, jenis liar mempunyai taburan sudut pembahagian sel yang lebih seragam, manakala mutan della global lebih menyukai pembahagian tangen seperti IP R (Rajah 6e). Kami juga mengukur orientasi pembahagian sel dalam SAM bagi mutan kuintupel ga2 oksidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, dan ga2ox6-2), latar belakang mutan tidak aktif GA di mana GA terkumpul. Selaras dengan peningkatan tahap GA, SAM bagi perbungaan mutan kuintupel ga2ox adalah lebih besar daripada Col-0 (Rajah Tambahan 12a, b), dan berbanding dengan Col-0, SAM kuintupel ga2ox menunjukkan taburan sudut pembahagian sel yang berbeza, dengan frekuensi sudut meningkat dari 50° hingga 90°, iaitu sekali lagi memihak kepada pembahagian tangen (Rajah Tambahan 12a–c). Oleh itu, kami menunjukkan bahawa pengaktifan konstitutif isyarat GA dan pengumpulan GA mendorong pembahagian sel lateral dalam IP R dan seluruh SAM.
a, b Visualisasi 3D lapisan L1 bagi Ler (a) dan mutan della global (b) yang diwarnakan PI menggunakan mikroskopi konfokal. Dinding sel baharu yang terbentuk dalam SAM (tetapi bukan primordium) dalam tempoh 10 jam ditunjukkan dan diwarnakan mengikut nilai sudutnya. Sisipan menunjukkan SAM pada 0 jam. Bar warna dipaparkan di sudut kanan bawah. Anak panah dalam (b) menunjukkan contoh fail sel sejajar dalam mutan della global. Eksperimen diulang dua kali dengan hasil yang serupa. perbandingan taburan frekuensi orientasi satah pembahagian sel dalam keseluruhan SAM (d), IP R (e), dan bukan IP R (f) antara Ler dan della global. Nilai P diperoleh menggunakan ujian Kolmogorov-Smirnov dua hujung. f, g Visualisasi 3D imej konfokal SAM yang diwarnakan PI bagi tumbuhan transgenik Col-0 (i) dan pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panel (a, b) menunjukkan dinding sel baharu (tetapi bukan primordia) yang terbentuk dalam SAM dalam masa 10 jam. Eksperimen diulang dua kali dengan hasil yang serupa. h–j Perbandingan taburan frekuensi orientasi satah pembahagian sel yang terletak di seluruh SAM (h), IP R (i) dan bukan IP R (j) antara tumbuhan Col-0 dan pCUC2::gai-1-VENUS. Nilai P diperoleh menggunakan ujian Kolmogorov–Smirnov dua hujung.
Kami seterusnya menguji kesan perencatan isyarat GA khususnya dalam IP R. Untuk tujuan ini, kami menggunakan promoter kotiledon cup 2 (CUC2) untuk memacu ekspresi protein gai-1 negatif dominan yang digabungkan dengan VENUS (dalam garisan pCUC2::gai-1-VENUS). Dalam SAM jenis liar, promoter CUC2 memacu ekspresi kebanyakan IP R dalam SAM, termasuk sel sempadan, dari P4 dan seterusnya, dan ekspresi khusus yang serupa diperhatikan dalam tumbuhan pCUC2::gai-1-VENUS (lihat di bawah). Taburan sudut pembahagian sel merentasi SAM atau IP R tumbuhan pCUC2::gai-1-VENUS tidak jauh berbeza daripada jenis liar, walaupun secara tidak dijangka kami mendapati bahawa sel tanpa IP R dalam tumbuhan ini membahagi pada frekuensi yang lebih tinggi iaitu 80–90° (Rajah 6f–j).
Telah dicadangkan bahawa arah pembahagian sel bergantung pada geometri SAM, khususnya tegasan tegangan yang dihasilkan oleh kelengkungan tisu46. Oleh itu, kami bertanya sama ada bentuk SAM telah diubah dalam tumbuhan mutan della global dan pCUC2::gai-1-VENUS. Seperti yang dilaporkan sebelum ini12, saiz mutan della global SAM adalah lebih besar daripada jenis liar (Rajah Tambahan 13a, b, d). Hibridisasi in situ CLV3 dan STM RNA mengesahkan pengembangan meristem dalam mutan della dan seterusnya menunjukkan pengembangan lateral niche sel stem (Rajah Tambahan 13e, f, h, i). Walau bagaimanapun, kelengkungan SAM adalah serupa dalam kedua-dua genotip (Rajah Tambahan 13k, m, n, p). Kami memerhatikan peningkatan saiz yang serupa dalam mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple tanpa perubahan kelengkungan berbanding dengan jenis liar (Rajah Tambahan 13c, d, g, j, l, o, p). Kekerapan orientasi pembahagian sel juga terjejas dalam mutan della quadruple, tetapi pada tahap yang lebih rendah berbanding mutan della monolitik (Rajah Tambahan 12d–f). Kesan dos ini, bersama-sama dengan kekurangan kesan pada kelengkungan, menunjukkan bahawa aktiviti RGL3 sisa dalam mutan Della quadruple menghadkan perubahan dalam orientasi pembahagian sel yang disebabkan oleh kehilangan aktiviti DELLA dan perubahan dalam pembahagian sel lateral berlaku sebagai tindak balas kepada perubahan dalam aktiviti isyarat GA dan bukannya perubahan dalam geometri SAM. Seperti yang diterangkan di atas, promoter CUC2 memacu ekspresi IP R dalam SAM bermula pada P4 (Rajah Tambahan 14a, b), dan sebaliknya, SAM pCUC2::gai-1-VENUS mempunyai saiz yang lebih kecil tetapi kelengkungan yang lebih tinggi (Rajah Tambahan 14c–h). Perubahan dalam morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS ini boleh mengakibatkan taburan tekanan mekanikal yang berbeza berbanding jenis liar, di mana tekanan lilitan yang tinggi bermula pada jarak yang lebih pendek dari pusat SAM47. Secara alternatifnya, perubahan dalam morfologi pCUC2::gai-1-VENUS SAM mungkin terhasil daripada perubahan dalam sifat mekanikal serantau yang disebabkan oleh ekspresi transgen48. Dalam kedua-dua kes, ini sebahagiannya boleh mengimbangi kesan perubahan dalam isyarat GA dengan meningkatkan kemungkinan sel akan membahagi dalam orientasi lilitan/melintang, menjelaskan pemerhatian kami.
Secara keseluruhannya, data kami mengesahkan bahawa pengisyaratan GA yang lebih tinggi memainkan peranan aktif dalam orientasi lateral satah pembahagian sel dalam IPR. Ia juga menunjukkan bahawa kelengkungan meristem juga mempengaruhi orientasi satah pembahagian sel dalam IPR.
Orientasi melintang satah pembahagian dalam IP R, disebabkan oleh aktiviti isyarat GA yang tinggi, menunjukkan bahawa GA menyusun fail sel jejarian terlebih dahulu dalam epidermis dalam SAM untuk menentukan organisasi selular yang kemudiannya akan ditemui dalam internod epidermis. Sesungguhnya, fail sel sedemikian kerap kelihatan dalam imej SAM bagi mutan della global (Rajah 6b). Oleh itu, untuk meneroka lebih lanjut fungsi perkembangan corak ruang isyarat GA dalam SAM, kami menggunakan pengimejan selang masa untuk menganalisis organisasi ruang sel dalam IP R dalam tumbuhan transgenik jenis liar (Ler dan Col-0), mutan della global, dan pCUC2::gai-1-VENUS.
Kami mendapati bahawa qmRGA menunjukkan bahawa aktiviti isyarat GA dalam IP R meningkat daripada P1/P2 dan mencapai puncaknya pada P4, dan corak ini kekal malar dari semasa ke semasa (Rajah 4a–f dan Rajah Tambahan 8c–f, k). Untuk menganalisis organisasi ruang sel dalam IP R dengan peningkatan isyarat GA, kami melabelkan sel IP R Ler di atas dan di sisi P4 mengikut nasib perkembangannya yang dianalisis 34 jam selepas pemerhatian pertama, iaitu, lebih daripada dua kali plastid, membolehkan kami mengikuti sel IP R semasa perkembangan primordium dari P1/P2 hingga P4. Kami menggunakan tiga warna berbeza: kuning untuk sel-sel yang disepadukan ke dalam primordium berhampiran P4, hijau untuk sel-sel yang berada dalam IP R, dan ungu untuk sel-sel yang mengambil bahagian dalam kedua-dua proses (Rajah 7a–c). Pada t0 (0 jam), 1–2 lapisan sel IP R kelihatan di hadapan P4 (Rajah 7a). Seperti yang dijangkakan, apabila sel-sel ini membahagi, ia berlaku terutamanya melalui satah pembahagian melintang (Rajah 7a–c). Keputusan yang serupa diperoleh menggunakan Col-0 SAM (memberi tumpuan pada P3, yang sempadannya melipat serupa dengan P4 dalam Ler), walaupun dalam genotip ini, lipatan yang terbentuk di sempadan bunga menyembunyikan sel IP R dengan lebih cepat (Rajah 7g–i). Oleh itu, corak pembahagian sel IP R menyusun semula sel-sel tersebut kepada baris jejari, seperti dalam internod. Organisasi baris jejari dan penyetempatan sel IP R antara organ yang berturutan menunjukkan bahawa sel-sel ini adalah progenitor internod.
Di sini, kami membangunkan biosensor isyarat GA ratiometrik, qmRGA, yang membolehkan pemetaan kuantitatif aktiviti isyarat GA yang terhasil daripada gabungan kepekatan reseptor GA dan GA sambil meminimumkan gangguan dengan laluan isyarat endogen, sekali gus memberikan maklumat tentang fungsi GA pada peringkat selular. Untuk tujuan ini, kami membina protein DELLA yang diubah suai, mRGA, yang telah kehilangan keupayaan untuk mengikat rakan interaksi DELLA tetapi kekal sensitif terhadap proteolisis yang disebabkan oleh GA. qmRGA bertindak balas terhadap perubahan eksogen dan endogen dalam tahap GA, dan sifat penderiaan dinamiknya membolehkan penilaian perubahan spatiotemporal dalam aktiviti isyarat GA semasa perkembangan. qmRGA juga merupakan alat yang sangat fleksibel kerana ia boleh disesuaikan dengan tisu yang berbeza dengan menukar promoter yang digunakan untuk ekspresinya (jika perlu), dan memandangkan sifat laluan isyarat GA yang terpelihara dan motif PFYRE merentasi angiosperma, ia berkemungkinan boleh dipindahkan kepada spesies lain22. Selaras dengan ini, mutasi yang setara dalam protein SLR1 DELLA beras (HYY497AAA) juga ditunjukkan dapat menyekat aktiviti penindas pertumbuhan SLR1 sambil hanya sedikit mengurangkan degradasi yang dimediasi GA, serupa dengan mRGA23. Terutamanya, kajian terbaru dalam Arabidopsis menunjukkan bahawa mutasi asid amino tunggal dalam domain PFYRE (S474L) mengubah aktiviti transkripsi RGA tanpa menjejaskan keupayaannya untuk berinteraksi dengan rakan faktor transkripsi50. Walaupun mutasi ini sangat hampir dengan 3 penggantian asid amino yang terdapat dalam mRGA, kajian kami menunjukkan bahawa kedua-dua mutasi ini mengubah ciri-ciri DELLA yang berbeza. Walaupun kebanyakan rakan faktor transkripsi mengikat pada domain LHR1 dan SAW bagi DELLA26,51, beberapa asid amino terpelihara dalam domain PFYRE boleh membantu menstabilkan interaksi ini.
Perkembangan internod merupakan ciri utama dalam seni bina tumbuhan dan peningkatan hasil. qmRGA mendedahkan aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi dalam sel progenitor internod IP R. Dengan menggabungkan pengimejan kuantitatif dan genetik, kami menunjukkan bahawa corak isyarat GA menindih satah pembahagian sel bulat/melintang dalam epidermis SAM, membentuk organisasi pembahagian sel yang diperlukan untuk perkembangan internod. Beberapa pengawal selia orientasi satah pembahagian sel telah dikenal pasti semasa pembangunan52,53. Kerja kami memberikan contoh yang jelas tentang bagaimana aktiviti isyarat GA mengawal parameter selular ini. DELLA boleh berinteraksi dengan kompleks protein pralipatan41, jadi isyarat GA boleh mengawal orientasi satah pembahagian sel dengan mempengaruhi secara langsung orientasi mikrotubul kortikal40,41,54,55. Kami secara tidak dijangka menunjukkan bahawa dalam SAM, korelasi aktiviti isyarat GA yang lebih tinggi bukanlah pemanjangan atau pembahagian sel, tetapi hanya anisotropi pertumbuhan, yang konsisten dengan kesan langsung GA pada arah pembahagian sel dalam IP R. Walau bagaimanapun, kami tidak boleh menolak bahawa kesan ini juga boleh bersifat tidak langsung, contohnya dimediasi oleh pelembutan dinding sel yang disebabkan oleh GA56. Perubahan dalam sifat dinding sel mendorong tekanan mekanikal57,58, yang juga boleh mempengaruhi orientasi satah pembahagian sel dengan mempengaruhi orientasi mikrotubul kortikal39,46,59. Kesan gabungan tekanan mekanikal yang disebabkan oleh GA dan pengawalaturan langsung orientasi mikrotubul oleh GA mungkin terlibat dalam menghasilkan corak orientasi pembahagian sel tertentu dalam IPR untuk menentukan internod, dan kajian lanjut diperlukan untuk menguji idea ini. Begitu juga, kajian terdahulu telah menekankan kepentingan protein TCP14 dan 15 yang berinteraksi dengan DELLA dalam kawalan pembentukan internod60,61 dan faktor-faktor ini mungkin menjadi perantara tindakan GA bersama-sama dengan BREVIPEDICELLUS (BP) dan PENNYWISE (PNY), yang mengawal selia perkembangan internod dan telah terbukti mempengaruhi isyarat GA2,62. Memandangkan DELLA berinteraksi dengan laluan isyarat brassinosteroid, etilena, asid jasmonik dan asid absisik (ABA)63,64 dan hormon ini boleh mempengaruhi orientasi mikrotubul65, kesan GA pada orientasi pembahagian sel juga boleh dimediasi oleh hormon lain.
Kajian sitologi awal menunjukkan bahawa kedua-dua kawasan dalam dan luar SAM Arabidopsis diperlukan untuk perkembangan internod2,42. Hakikat bahawa GA secara aktif mengawal selia pembahagian sel dalam tisu dalam12 menyokong fungsi ganda GA dalam mengawal selia saiz meristem dan internod dalam SAM. Corak pembahagian sel berarah juga dikawal selia dengan ketat dalam tisu SAM dalam, dan peraturan ini penting untuk pertumbuhan batang52. Adalah menarik untuk mengkaji sama ada GA juga memainkan peranan dalam mengorientasikan satah pembahagian sel dalam organisasi SAM dalam, sekali gus menyegerakkan spesifikasi dan perkembangan internod dalam SAM.
Tumbuhan ditanam secara in vitro dalam tanah atau 1x medium Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) yang ditambah dengan 1% sukrosa dan 1% agar (Sigma) di bawah keadaan standard (cahaya 16 jam, 22 °C), kecuali untuk eksperimen hipokotil dan pertumbuhan akar di mana anak benih ditanam pada plat menegak di bawah cahaya malar dan 22 °C. Bagi eksperimen nitrat, tumbuhan ditanam pada medium MS yang diubah suai (medium tumbuhan bioWORLD) yang ditambah dengan nitrat yang mencukupi (0 atau 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa dan 1% A-agar (Sigma) di bawah keadaan hari panjang.
cDNA GID1a yang dimasukkan ke dalam pDONR221 telah digabungkan semula dengan pDONR P4-P1R-pUBQ10 dan pDONR P2R-P3-mCherry ke dalam pB7m34GW untuk menghasilkan pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 yang dimasukkan ke dalam pDONR221 telah digabungkan semula ke dalam pB7RWG266 untuk menghasilkan p35S:IDD2-RFP. Untuk menjana pGID1b::2xmTQ2-GID1b, serpihan 3.9 kb di hulu kawasan pengekodan GID1b dan serpihan 4.7 kb yang mengandungi cDNA GID1b (1.3 kb) dan terminator (3.4 kb) telah dikuatkan terlebih dahulu menggunakan primer dalam Jadual Tambahan 3 dan kemudian dimasukkan ke dalam pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) dan pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), dan akhirnya digabungkan semula dengan pDONR221 2xmTQ268 ke dalam vektor sasaran pGreen 012567 menggunakan pengklonan Gateway. Untuk menjana pCUC2::LSSmOrange, jujukan promoter CUC2 (3229 bp di hulu ATG) diikuti dengan jujukan pengekodan mOrange anjakan Stokes yang besar (LSSmOrange)69 dengan isyarat penyetempatan nuklear N7 dan terminator transkripsi NOS telah dipasang ke dalam vektor penargetan kanamycin pGreen menggunakan sistem penggabungan semula serpihan Gateway 3 (Invitrogen). Vektor binari tumbuhan telah diperkenalkan ke dalam strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 dan diperkenalkan ke dalam daun Nicotiana benthamiana melalui kaedah penyusupan Agrobacterium dan ke dalam Arabidopsis thaliana Col-0 melalui kaedah celup bunga. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry dan pCLV3::mCherry-NLS qmRGA telah diasingkan daripada progeni F3 dan F1 bagi kacukan masing-masing.
Hibridisasi in situ RNA dilakukan pada hujung pucuk yang panjangnya lebih kurang 1 cm72, yang dikumpulkan dan segera difiksasi dalam larutan FAA (3.7% formaldehid, 5% asid asetik, 50% etanol) yang disejukkan terlebih dahulu kepada 4 °C. Selepas rawatan vakum selama 2 × 15 minit, fiksatif ditukar dan sampel diinkubasi semalaman. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, dan RGL3 serta prob antisense kepada 3′-UTR mereka telah disintesis menggunakan primer yang ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 3 seperti yang diterangkan oleh Rosier et al.73. Probe berlabel Digoxigenin telah dikesan secara imun menggunakan antibodi digoxigenin (pencairan 3000 kali ganda; Roche, nombor katalog: 11 093 274 910), dan bahagian-bahagian telah diwarnakan dengan larutan 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, pencairan 250 kali ganda)/nitroblue tetrazolium (NBT, pencairan 200 kali ganda).
Masa siaran: 10-Feb-2025