Fosforilasi mengaktifkan pengatur pertumbuhan induk DELLA, menggalakkan pengikatan histon H2A kepada kromatin dalam Arabidopsis.

Protein DELLA dipeliharapengawal selia pertumbuhanyang memainkan peranan penting dalam perkembangan tumbuhan sebagai tindak balas kepada isyarat dalaman dan luaran. Sebagai pengawal selia transkripsi, DELLA mengikat kepada faktor transkripsi (TF) dan histon H2A melalui domain GRAS mereka dan direkrut untuk bertindak ke atas promoter. Kajian terbaru menunjukkan bahawa kestabilan DELLA dikawal selia secara pasca-translasi oleh dua mekanisme: poliubiquitinasi yang disebabkan oleh hormon tumbuhangiberelin, yang membawa kepada degradasi pesatnya, dan konjugasi dengan pengubah suai seperti ubiquitin kecil (SUMO), yang meningkatkan pengumpulannya. Selain itu, aktiviti DELLA dikawal secara dinamik oleh dua mekanisme glikosilasi yang berbeza: O-fucosilation meningkatkan interaksi DELLA-TF, manakala pengubahsuaian N-asetilglukosamin (O-GlcNAc) yang berkaitan dengan O menghalang interaksi DELLA-TF. Walau bagaimanapun, peranan fosforilasi DELLA tidak jelas kerana kajian terdahulu telah menunjukkan hasil yang bercanggah, dengan sesetengahnya mencadangkan bahawa fosforilasi menggalakkan atau menindas degradasi DELLA dan yang lain mencadangkan bahawa fosforilasi tidak menjejaskan kestabilannya. Di sini, kami mengenal pasti tapak fosforilasi dalam penindas GA1-3 (RGA), AtDELLA, yang ditulenkan daripada Arabidopsis thaliana melalui spektrometri jisim dan menunjukkan bahawa fosforilasi dua peptida RGA di kawasan PolyS dan PolyS/T meningkatkan aktiviti RGA dengan menggalakkan pengikatan H2A dan perkaitan RGA dengan promoter sasaran. Terutamanya, fosforilasi tidak menjejaskan interaksi RGA-TF atau kestabilan RGA. Kajian kami mendedahkan mekanisme molekul yang mana fosforilasi mendorong aktiviti DELLA.
Analisis spektrometri jisim kami mendedahkan bahawa kedua-dua Pep1 dan Pep2 telah terfosforilasi tinggi dalam RGA dalam latar belakang Ga1 yang kekurangan GA. Selain kajian ini, kajian fosfoproteomik juga telah mendedahkan fosforilasi Pep1 dalam RGA, walaupun peranannya belum dikaji53,54,55. Sebaliknya, fosforilasi Pep2 belum diterangkan sebelum ini kerana peptida ini hanya boleh dikesan menggunakan transgen RGAGKG. Walaupun mutasi m1A, yang menghapuskan fosforilasi Pep1, hanya sedikit mengurangkan aktiviti RGA dalam planta, ia mempunyai kesan tambahan apabila digabungkan dengan m2A dalam mengurangkan aktiviti RGA (Rajah Tambahan 6). Yang penting, fosforilasi Pep1 berkurangan dengan ketara dalam mutan sly1 yang dipertingkatkan GA berbanding ga1, menunjukkan bahawa GA menggalakkan defosforilasi RGA, sekali gus mengurangkan aktivitinya. Mekanisme GA menyekat fosforilasi RGA memerlukan siasatan lanjut. Satu kemungkinan ialah ini dicapai melalui pengawalaturan protein kinase yang tidak dikenal pasti. Walaupun kajian telah menunjukkan bahawa ekspresi protein kinase CK1 EL1 dikurangkan oleh GA dalam beras41, keputusan kami menunjukkan bahawa mutasi peringkat tinggi homolog Arabidopsis EL1 (AEL1-4) tidak mengurangkan fosforilasi RGA. Selaras dengan keputusan kami, kajian fosfoproteomik baru-baru ini menggunakan garisan ekspresi Arabidopsis AEL yang berlebihan dan mutan rangkap tiga ael tidak mengenal pasti sebarang protein DELLA sebagai substrat kinase ini56. Apabila kami menyediakan manuskrip, dilaporkan bahawa GSK3, gen yang mengekod kinase seperti GSK3/SHAGGY dalam gandum (Triticum aestivum), boleh memfosforilasi DELLA (Rht-B1b)57, walaupun fosforilasi Rht-B1b oleh GSK3 belum disahkan dalam planta. Tindak balas enzimatik in vitro dengan kehadiran GSK3 diikuti dengan analisis spektrometri jisim mendedahkan tiga tapak fosforilasi yang terletak di antara domain DELLA dan GRAS Rht-B1b (Rajah Tambahan 3). Penggantian serina kepada alanina di ketiga-tiga tapak fosforilasi mengakibatkan penurunan aktiviti Rht-B1b dalam gandum transgenik, selaras dengan penemuan kami bahawa penggantian alanina dalam Pep2 RGA mengurangkan aktiviti RGA. Walau bagaimanapun, ujian degradasi protein in vitro menunjukkan lagi bahawa fosforilasi juga boleh menstabilkan Rht-B1b57. Ini berbeza dengan keputusan kami yang menunjukkan bahawa penggantian alanina dalam Pep2 RGA tidak mengubah kestabilannya dalam planta. GSK3 dalam gandum ialah ortolog protein 2 yang tidak sensitif terhadap brassinosteroid (BIN2) dalam Arabidopsis 57. BIN2 ialah pengawal selia negatif bagi isyarat BR, dan BR mengaktifkan laluan isyaratnya dengan menyebabkan degradasi BIN2 58. Kami menunjukkan bahawa rawatan BR tidak mengurangkan kestabilan RGA 59 atau tahap fosforilasi dalam Arabidopsis (Rajah Tambahan 2), menunjukkan bahawa RGA tidak mungkin difosforilasi oleh BIN2.
Semua data kuantitatif dianalisis secara statistik menggunakan Excel, dan perbezaan yang ketara ditentukan menggunakan ujian-t Student. Tiada kaedah statistik digunakan untuk menentukan saiz sampel terlebih dahulu. Tiada data dikecualikan daripada analisis; eksperimen tidak rawak; dan penyelidik menyedari peruntukan semasa eksperimen dan penilaian hasil. Saiz sampel disediakan dalam legenda rajah dan dalam fail data mentah.