Fosforilasi mengaktifkan pengatur pertumbuhan induk DELLA, menggalakkan pengikatan histon H2A kepada kromatin dalam Arabidopsis.

Protein DELLA dipeliharapengawal selia pertumbuhanyang memainkan peranan penting dalam pembangunan tumbuhan sebagai tindak balas kepada isyarat dalaman dan luaran. Sebagai pengawal selia transkrip, DELLA mengikat faktor transkripsi (TF) dan histon H2A melalui domain GRAS mereka dan direkrut untuk bertindak ke atas promoter. Kajian terkini telah menunjukkan bahawa kestabilan DELLA dikawal selepas translasi melalui dua mekanisme: poliubiquitinasi yang disebabkan oleh hormon tumbuhangiberelin, yang membawa kepada kemerosotan pesatnya, dan konjugasi dengan pengubah kecil seperti ubiquitin (SUMO), yang meningkatkan pengumpulannya. Selain itu, aktiviti DELLA dikawal secara dinamik oleh dua mekanisme glikosilasi yang berbeza: O-fucosylation meningkatkan interaksi DELLA-TF, manakala pengubahsuaian N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) berkaitan O menghalang interaksi DELLA-TF. Walau bagaimanapun, peranan fosforilasi DELLA tidak jelas kerana kajian terdahulu telah menunjukkan hasil yang bercanggah, dengan sesetengahnya mencadangkan bahawa fosforilasi menggalakkan atau menindas degradasi DELLA dan yang lain mencadangkan bahawa fosforilasi tidak menjejaskan kestabilan mereka. Di sini, kami mengenal pasti tapak fosforilasi dalam penindas GA1-3 (RGA), AtDELLA, disucikan daripada Arabidopsis thaliana oleh spektrometri jisim dan menunjukkan bahawa fosforilasi dua peptida RGA di kawasan PolyS dan PolyS / T meningkatkan aktiviti RGA dengan mempromosikan pengikatan H2A dan persatuan RGA dengan penganjur sasaran. Terutama, fosforilasi tidak menjejaskan interaksi RGA-TF atau kestabilan RGA. Kajian kami mendedahkan mekanisme molekul yang mana fosforilasi mendorong aktiviti DELLA.
Analisis spektrometri jisim kami mendedahkan bahawa kedua-dua Pep1 dan Pep2 sangat terfosforilasi dalam RGA dalam latar belakang Ga1 yang kekurangan GA. Sebagai tambahan kepada kajian ini, kajian fosfoproteomik juga telah mendedahkan fosforilasi Pep1 dalam RGA, walaupun peranannya belum dikaji53,54,55. Sebaliknya, fosforilasi Pep2 tidak pernah diterangkan sebelum ini kerana peptida ini hanya dapat dikesan menggunakan transgen RGAGKG. Walaupun mutasi m1A, yang menghapuskan fosforilasi Pep1, hanya mengurangkan sedikit aktiviti RGA dalam planta, ia mempunyai kesan tambahan apabila digabungkan dengan m2A dalam mengurangkan aktiviti RGA (Tambahan Rajah 6). Yang penting, fosforilasi Pep1 telah dikurangkan dengan ketara dalam mutan sly1 yang dipertingkatkan GA berbanding ga1, menunjukkan bahawa GA menggalakkan defosforilasi RGA, mengurangkan aktivitinya. Mekanisme yang mana GA menindas fosforilasi RGA memerlukan siasatan lanjut. Satu kemungkinan adalah bahawa ini dicapai melalui pengawalan kinase protein yang tidak dikenali. Walaupun kajian telah menunjukkan bahawa ekspresi protein kinase CK1 EL1 dikurangkan oleh GA dalam beras41, keputusan kami menunjukkan bahawa mutasi peringkat tinggi homolog Arabidopsis EL1 (AEL1-4) tidak mengurangkan fosforilasi RGA. Selaras dengan keputusan kami, kajian fosfoproteomik baru-baru ini menggunakan garis overexpressing Arabidopsis AEL dan mutant triple ael tidak mengenal pasti sebarang protein DELLA sebagai substrat kinase56 ini. Apabila kami menyediakan manuskrip, dilaporkan bahawa GSK3, gen yang mengekodkan kinase seperti GSK3/SHAGGY dalam gandum (Triticum aestivum), boleh memfosforilasi DELLA (Rht-B1b)57, walaupun fosforilasi Rht-B1b oleh GSK3 belum disahkan dalam planta. Tindak balas enzim in vitro dengan kehadiran GSK3 diikuti oleh analisis spektrometri jisim mendedahkan tiga tapak fosforilasi yang terletak di antara domain DELLA dan GRAS Rht-B1b (Tambahan Rajah 3). Penggantian serin kepada alanin di ketiga-tiga tapak fosforilasi mengakibatkan penurunan aktiviti Rht-B1b dalam gandum transgenik, selaras dengan penemuan kami bahawa penggantian alanin dalam Pep2 RGA menurunkan aktiviti RGA. Walau bagaimanapun, ujian degradasi protein in vitro selanjutnya menunjukkan bahawa fosforilasi juga boleh menstabilkan Rht-B1b57. Ini berbeza dengan keputusan kami yang menunjukkan bahawa penggantian alanin dalam Pep2 RGA tidak mengubah kestabilannya dalam planta. GSK3 dalam gandum ialah ortolog protein tidak sensitif brassinosteroid 2 (BIN2) dalam Arabidopsis 57. BIN2 ialah pengawal selia negatif bagi isyarat BR, dan BR mengaktifkan laluan isyaratnya dengan menyebabkan kemerosotan BIN2 58. Kami menunjukkan bahawa rawatan BR tidak mengurangkan kestabilan RGA 59 atau tahap fosforilasi dalam Arabidopsis tidak serupa dengan RGA2 Suplemen Figure Suplemen (RGA) difosforilasi oleh BIN2.
Semua data kuantitatif dianalisis secara statistik menggunakan Excel, dan perbezaan yang signifikan ditentukan menggunakan ujian-t Pelajar. Tiada kaedah statistik digunakan untuk pra-menentukan saiz sampel. Tiada data dikecualikan daripada analisis; eksperimen tidak rawak; dan penyelidik menyedari peruntukan semasa eksperimen dan penilaian hasil. Saiz sampel disediakan dalam legenda angka dan dalam fail data mentah.