Kajian ini menilai tahap kematian, subkematian, dan ketoksikan bahan komersialsipermetrinFormulasi kepada berudu anuran. Dalam ujian akut, kepekatan 100–800 μg/L telah diuji selama 96 jam. Dalam ujian kronik, kepekatan sipermetrin yang berlaku secara semula jadi (1, 3, 6, dan 20 μg/L) telah diuji untuk kematian, diikuti dengan ujian mikronukleus dan keabnormalan nuklear sel darah merah selama 7 hari. LC50 formulasi sipermetrin komersial kepada berudu ialah 273.41 μg L−1. Dalam ujian kronik, kepekatan tertinggi (20 μg L−1) mengakibatkan lebih daripada 50% kematian, kerana ia membunuh separuh daripada berudu yang diuji. Ujian mikronukleus menunjukkan keputusan yang ketara pada 6 dan 20 μg L−1 dan beberapa keabnormalan nuklear dikesan, menunjukkan bahawa formulasi sipermetrin komersial mempunyai potensi genotoksik terhadap P. gracilis. Sipermetrin berisiko tinggi untuk spesies ini, menunjukkan bahawa ia boleh menyebabkan pelbagai masalah dan menjejaskan dinamik ekosistem ini dalam jangka pendek dan panjang. Oleh itu, dapat disimpulkan bahawa formulasi sipermetrin komersial mempunyai kesan toksik terhadap P. gracilis.
Disebabkan oleh perkembangan berterusan aktiviti pertanian dan aplikasi intensifkawalan perosakDalam langkah-langkah pencegahan, haiwan akuatik kerap terdedah kepada racun perosak1,2. Pencemaran sumber air berhampiran ladang pertanian boleh menjejaskan perkembangan dan kemandirian organisma bukan sasaran seperti amfibia.
Amfibia menjadi semakin penting dalam penilaian matriks persekitaran. Anuran dianggap sebagai bioindikator yang baik untuk pencemar alam sekitar kerana ciri-ciri uniknya seperti kitaran hidup yang kompleks, kadar pertumbuhan larva yang cepat, status trofik, kulit yang telap10,11, pergantungan pada air untuk pembiakan12 dan telur yang tidak dilindungi11,13,14. Katak air kecil (Physalaemus gracilis), yang biasanya dikenali sebagai katak menangis, telah terbukti sebagai spesies bioindikator pencemaran racun perosak4,5,6,7,15. Spesies ini ditemui di perairan bertakung, kawasan perlindungan atau kawasan dengan habitat yang berubah-ubah di Argentina, Uruguay, Paraguay dan Brazil1617 dan dianggap stabil oleh klasifikasi IUCN kerana taburannya yang luas dan toleransi terhadap habitat yang berbeza18.
Kesan sublethal telah dilaporkan dalam amfibia berikutan pendedahan kepada sipermetrin, termasuk perubahan tingkah laku, morfologi dan biokimia pada berudu23,24,25, perubahan mortaliti dan masa metamorfosis, perubahan enzimatik, penurunan kejayaan penetasan24,25, hiperaktiviti26, perencatan aktiviti kolinesterase27 dan perubahan dalam prestasi renang7,28. Walau bagaimanapun, kajian tentang kesan genotoksik sipermetrin dalam amfibia adalah terhad. Oleh itu, adalah penting untuk menilai kerentanan spesies anuran terhadap sipermetrin.
Pencemaran alam sekitar menjejaskan pertumbuhan dan perkembangan normal amfibia, tetapi kesan buruk yang paling serius ialah kerosakan genetik kepada DNA yang disebabkan oleh pendedahan racun perosak13. Analisis morfologi sel darah merupakan bioindikator penting pencemaran dan potensi ketoksikan sesuatu bahan kepada spesies liar29. Ujian mikronukleus merupakan salah satu kaedah yang paling biasa digunakan untuk menentukan genotoksisiti bahan kimia dalam persekitaran30. Ia merupakan kaedah yang cepat, berkesan dan murah yang merupakan penunjuk yang baik bagi pencemaran kimia organisma seperti amfibia31,32 dan boleh memberikan maklumat tentang pendedahan kepada bahan pencemar genotoksik33.
Objektif kajian ini adalah untuk menilai potensi toksik formulasi sipermetrin komersial terhadap berudu akuatik kecil menggunakan ujian mikronukleus dan penilaian risiko ekologi.
Kematian kumulatif (%) berudu P. gracilis yang terdedah kepada kepekatan sipermetrin komersial yang berbeza semasa tempoh akut ujian.
Kematian kumulatif (%) berudu P. gracilis yang terdedah kepada kepekatan sipermetrin komersial yang berbeza semasa ujian kronik.
Kematian tinggi yang diperhatikan adalah akibat daripada kesan genotoksik pada amfibia yang terdedah kepada kepekatan sipermetrin yang berbeza (6 dan 20 μg/L), seperti yang dibuktikan oleh kehadiran mikronukleus (MN) dan keabnormalan nuklear dalam eritrosit. Pembentukan MN menunjukkan ralat dalam mitosis dan dikaitkan dengan pengikatan kromosom yang lemah pada mikrotubul, kecacatan dalam kompleks protein yang bertanggungjawab untuk pengambilan dan pengangkutan kromosom, ralat dalam pengasingan kromosom dan ralat dalam pembaikan kerosakan DNA38,39 dan mungkin berkaitan dengan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh racun perosak40,41. Keabnormalan lain diperhatikan pada semua kepekatan yang dinilai. Peningkatan kepekatan sipermetrin meningkatkan keabnormalan nuklear dalam eritrosit sebanyak 5% dan 20% masing-masing pada dos terendah (1 μg/L) dan tertinggi (20 μg/L). Contohnya, perubahan dalam DNA spesies boleh membawa akibat yang serius untuk kelangsungan hidup jangka pendek dan panjang, mengakibatkan penurunan populasi, perubahan kecergasan reproduktif, pembiakan dalaman, kehilangan kepelbagaian genetik, dan perubahan kadar migrasi. Semua faktor ini boleh memberi kesan kepada kelangsungan hidup dan penyelenggaraan spesies42,43. Pembentukan keabnormalan eritroid mungkin menunjukkan sekatan dalam sitokinesis, mengakibatkan pembahagian sel yang tidak normal (eritrosit berinukleus)44,45; nukleus berbilang lobus adalah unjuran membran nuklear dengan berbilang lobus46, manakala keabnormalan eritroid lain mungkin dikaitkan dengan amplifikasi DNA, seperti ginjal/bleb nuklear47. Kehadiran eritrosit anukleus mungkin menunjukkan pengangkutan oksigen yang terjejas, terutamanya dalam air yang tercemar48,49. Apoptosis menunjukkan kematian sel50.
Kajian-kajian lain juga telah menunjukkan kesan genotoksik sipermetrin. Kabaña et al.51 menunjukkan kehadiran perubahan mikronukleus dan nuklear seperti sel binukleus dan sel apoptosis dalam sel Odontophrynus americanus selepas terdedah kepada kepekatan tinggi sipermetrin (5000 dan 10,000 μg L−1) selama 96 jam. Apoptosis yang disebabkan oleh sipermetrin juga dikesan dalam P. biligonigerus52 dan Rhinella arenarum53. Keputusan ini menunjukkan bahawa sipermetrin mempunyai kesan genotoksik pada pelbagai organisma akuatik dan ujian MN dan ENA mungkin merupakan penunjuk kesan sublethal pada amfibia dan mungkin boleh digunakan untuk spesies asli dan populasi liar yang terdedah kepada bahan toksik12.
Formulasi komersial sipermetrin menimbulkan bahaya alam sekitar yang tinggi (akut dan kronik), dengan HQ melebihi tahap Agensi Perlindungan Alam Sekitar AS (EPA)54 yang boleh menjejaskan spesies secara negatif jika terdapat di alam sekitar. Dalam penilaian risiko kronik, NOEC untuk kematian ialah 3 μg L−1, mengesahkan bahawa kepekatan yang terdapat di dalam air boleh menimbulkan risiko kepada spesies55. NOEC yang membawa maut untuk larva R. arenarum yang terdedah kepada campuran endosulfan dan sipermetrin ialah 500 μg L−1 selepas 168 jam; nilai ini menurun kepada 0.0005 μg L−1 selepas 336 jam. Penulis menunjukkan bahawa semakin lama pendedahan, semakin rendah kepekatan yang berbahaya kepada spesies. Adalah juga penting untuk menekankan bahawa nilai NOEC adalah lebih tinggi daripada P. gracilis pada masa pendedahan yang sama, menunjukkan bahawa tindak balas spesies terhadap sipermetrin adalah khusus untuk spesies. Tambahan pula, dari segi kematian, nilai CHQ P. gracilis selepas terdedah kepada sipermetrin mencapai 64.67, iaitu lebih tinggi daripada nilai rujukan yang ditetapkan oleh Agensi Perlindungan Alam Sekitar AS54, dan nilai CHQ larva R. arenarum juga lebih tinggi daripada nilai ini (CHQ > 388.00 selepas 336 jam), menunjukkan bahawa racun serangga yang dikaji menimbulkan risiko tinggi kepada beberapa spesies amfibia. Memandangkan P. gracilis memerlukan kira-kira 30 hari untuk melengkapkan metamorfosis56, dapat disimpulkan bahawa kepekatan sipermetrin yang dikaji boleh menyumbang kepada penurunan populasi dengan menghalang individu yang dijangkiti daripada memasuki peringkat dewasa atau reproduktif pada usia muda.
Dalam penilaian risiko mikronukleus dan keabnormalan nuklear eritrosit yang lain yang dikira, nilai CHQ adalah antara 14.92 hingga 97.00, menunjukkan bahawa sipermetrin mempunyai potensi risiko genotoksik kepada P. gracilis walaupun di habitat semula jadinya. Dengan mengambil kira kematian, kepekatan maksimum sebatian xenobiotik yang boleh diterima oleh P. gracilis ialah 4.24 μg L−1. Walau bagaimanapun, kepekatan serendah 1 μg/L juga menunjukkan kesan genotoksik. Fakta ini boleh menyebabkan peningkatan bilangan individu yang tidak normal57 dan menjejaskan perkembangan dan pembiakan spesies di habitat mereka, yang membawa kepada penurunan populasi amfibia.
Formulasi komersial racun serangga sipermetrin menunjukkan ketoksikan akut dan kronik yang tinggi terhadap P. gracilis. Kadar kematian yang lebih tinggi diperhatikan, mungkin disebabkan oleh kesan toksik, seperti yang dibuktikan oleh kehadiran keabnormalan nuklear mikronukleus dan eritrosit, terutamanya nukleus bergerigi, nukleus berlobus, dan nukleus vesikular. Di samping itu, spesies yang dikaji menunjukkan peningkatan risiko alam sekitar, baik akut mahupun kronik. Data ini, digabungkan dengan kajian terdahulu oleh kumpulan penyelidikan kami, menunjukkan bahawa formulasi komersial sipermetrin yang berbeza masih menyebabkan penurunan aktiviti asetilkolinesterase (AChE) dan butirilkolinesterase (BChE) dan tekanan oksidatif58, dan mengakibatkan perubahan dalam aktiviti renang dan kecacatan oral59 dalam P. gracilis, menunjukkan bahawa formulasi komersial sipermetrin mempunyai ketoksikan maut dan submaut yang tinggi terhadap spesies ini. Hartmann et al. 60 mendapati bahawa formulasi komersial sipermetrin adalah yang paling toksik kepada P. gracilis dan spesies lain daripada genus yang sama (P. cuvieri) berbanding sembilan racun perosak lain. Ini menunjukkan bahawa kepekatan sipermetrin yang diluluskan secara sah untuk perlindungan alam sekitar boleh mengakibatkan kematian yang tinggi dan penurunan populasi dalam jangka masa panjang.
Kajian lanjut diperlukan untuk menilai ketoksikan racun perosak terhadap amfibia, kerana kepekatan yang terdapat di persekitaran boleh menyebabkan kematian yang tinggi dan menimbulkan potensi risiko kepada P. gracilis. Penyelidikan mengenai spesies amfibia harus digalakkan, kerana data mengenai organisma ini terhad, terutamanya mengenai spesies Brazil.
Ujian ketoksikan kronik berlangsung selama 168 jam (7 hari) di bawah keadaan statik dan kepekatan sublethal adalah: 1, 3, 6 dan 20 μg ai L−1. Dalam kedua-dua eksperimen, 10 berudu setiap kumpulan rawatan dinilai dengan enam replika, dengan sejumlah 60 berudu setiap kepekatan. Sementara itu, rawatan air sahaja berfungsi sebagai kawalan negatif. Setiap persediaan eksperimen terdiri daripada piring kaca steril dengan kapasiti 500 ml dan ketumpatan 1 berudu setiap 50 ml larutan. Kelalang ditutup dengan filem polietilena untuk mengelakkan penyejatan dan diudarakan secara berterusan.
Air tersebut dianalisis secara kimia untuk menentukan kepekatan racun perosak pada 0, 96, dan 168 jam. Menurut Sabin et al. 68 dan Martins et al. 69, analisis telah dijalankan di Makmal Analisis Pestisid (LARP) Universiti Persekutuan Santa Maria menggunakan kromatografi gas yang digandingkan dengan spektrometri jisim tiga kuadrupole (Varian model 1200, Palo Alto, California, Amerika Syarikat). Penentuan kuantitatif racun perosak dalam air ditunjukkan sebagai bahan tambahan (Jadual SM1).
Untuk ujian mikronukleus (MNT) dan ujian keabnormalan nuklear sel darah merah (RNA), 15 ekor berudu daripada setiap kumpulan rawatan telah dianalisis. Berudu telah dibius dengan 5% lidokain (50 mg g-170) dan sampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung menggunakan picagari heparin pakai buang. Calitan darah disediakan pada slaid mikroskop steril, dikeringkan di udara, difiksasi dengan 100% metanol (4 °C) selama 2 minit, dan kemudian diwarnakan dengan larutan Giemsa 10% selama 15 minit dalam keadaan gelap. Pada akhir proses, slaid dibasuh dengan air suling untuk menghilangkan lebihan kotoran dan dikeringkan pada suhu bilik.
Sekurang-kurangnya 1000 RBC daripada setiap berudu telah dianalisis menggunakan mikroskop 100× dengan objektif 71 untuk menentukan kehadiran MN dan ENA. Sebanyak 75,796 RBC daripada berudu telah dinilai dengan mengambil kira kepekatan sipermetrin dan kawalan. Genotoksisiti telah dianalisis mengikut kaedah Carrasco et al. dan Fenech et al.38,72 dengan menentukan kekerapan lesi nuklear berikut: (1) sel anukleat: sel tanpa nukleus; (2) sel apoptosis: pemecahan nuklear, kematian sel terprogram; (3) sel binukleat: sel dengan dua nukleus; (4) tunas nuklear atau sel bleb: sel dengan nukleus dengan unjuran kecil membran nuklear, bleb yang serupa saiznya dengan mikronukleus; (5) sel kariolisis: sel dengan hanya garis luar nukleus tanpa bahan dalaman; (6) sel bertakuk: sel dengan nukleus dengan retakan atau takik yang jelas dalam bentuknya, juga dipanggil nukleus berbentuk buah pinggang; (7) sel berlobulus: sel dengan unjuran nuklear yang lebih besar daripada vesikel yang dinyatakan di atas; dan (8) mikrosel: sel dengan nukleus pekat dan sitoplasma yang berkurangan. Perubahan tersebut dibandingkan dengan keputusan kawalan negatif.
Keputusan ujian ketoksikan akut (LC50) telah dianalisis menggunakan perisian GBasic dan kaedah TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Data ujian kronik telah diuji terlebih dahulu untuk kenormalan ralat (Shapiro-Wilks) dan homogeniti varians (Bartlett). Keputusan dianalisis menggunakan analisis varians sehala (ANOVA). Ujian Tukey digunakan untuk membandingkan data antara mereka sendiri, dan ujian Dunnett digunakan untuk membandingkan data antara kumpulan rawatan dan kumpulan kawalan negatif.
Data LOEC dan NOEC dianalisis menggunakan ujian Dunnett. Ujian statistik dijalankan menggunakan perisian Statistica 8.0 (StatSoft) dengan aras signifikansi 95% (p < 0.05).
Masa siaran: 13 Mac 2025