Nematod pain ialah endoparasit migrasi kuarantin yang diketahui menyebabkan kerugian ekonomi yang teruk dalam ekosistem hutan pain. Kajian ini mengkaji aktiviti nematicidal indole terhalogen terhadap nematod pain dan mekanisme tindakannya. Aktiviti nematicidal 5-iodoindole dan avermectin (kawalan positif) terhadap nematod pain adalah serupa dan tinggi pada kepekatan rendah (10 μg/mL). 5-iodoindole mengurangkan kesuburan, aktiviti pembiakan, kematian embrio dan larva, dan tingkah laku lokomotor. Interaksi molekul ligan dengan reseptor saluran klorida berpagar glutamat khusus invertebrata menyokong tanggapan bahawa 5-iodoindole, seperti avermectin, mengikat ketat pada tapak aktif reseptor. 5-Iodoindole juga menyebabkan pelbagai ubah bentuk fenotip dalam nematod, termasuk keruntuhan/pengecutan organ yang tidak normal dan peningkatan vakuolisasi. Keputusan ini menunjukkan bahawa vakuol mungkin memainkan peranan dalam kematian pengantara metilasi nematod. Yang penting, 5-iodoindole tidak toksik kepada kedua-dua spesies tumbuhan (kubis dan lobak). Oleh itu, kajian ini menunjukkan bahawa penggunaan iodoindole dalam keadaan persekitaran boleh mengawal kecederaan layu pain.
Nematod kayu pain (Bursaphelenchus xylophilus) tergolong dalam nematod kayu pain (PWN), nematod endoparasitik migrasi yang diketahui menyebabkan kerosakan ekologi teruk kepada ekosistem hutan pain1. Penyakit layu pain (PWD) yang disebabkan oleh nematod kayu pain menjadi masalah serius di beberapa benua, termasuk Asia dan Eropah, dan di Amerika Utara, nematod memusnahkan spesies pain yang diperkenalkan1,2. Kemerosotan pokok pain adalah masalah ekonomi utama, dan prospek penyebaran globalnya membimbangkan3. Spesies pain berikut paling kerap diserang oleh nematod: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, dan Pinus radiata4. Nematod pain adalah penyakit serius yang boleh membunuh pokok pain dalam beberapa minggu atau bulan jangkitan. Di samping itu, wabak nematod pain adalah perkara biasa dalam pelbagai ekosistem, jadi rantaian jangkitan berterusan telah diwujudkan1.
Bursaphelenchus xylophilus ialah nematod parasit tumbuhan kuarantin kepunyaan superfamili Aphelenchoidea dan klad 102.5. Nematod memakan kulat dan membiak dalam tisu kayu pokok pain, berkembang menjadi empat peringkat larva yang berbeza: L1, L2, L3, L4 dan individu dewasa1,6. Di bawah keadaan kekurangan makanan, nematod pain memasuki peringkat larva khusus - dauer, yang memparasitkan vektornya - kumbang kulit kayu pain (Monochamus alternatus) dan dipindahkan ke pokok pain yang sihat. Dalam perumah yang sihat, nematod cepat berhijrah melalui tisu tumbuhan dan memakan sel parenkim, yang membawa kepada beberapa tindak balas hipersensitiviti, layu pain dan kematian dalam tempoh setahun selepas jangkitan1,7,8.
Kawalan biologi nematod pain telah lama menjadi cabaran, dengan langkah kuarantin sejak abad ke-20. Strategi semasa untuk mengawal nematod pain terutamanya melibatkan rawatan kimia, termasuk pengasapan kayu dan implantasi nematisida ke dalam batang pokok. Nematisida yang paling biasa digunakan ialah avermectin dan avermectin benzoate, yang tergolong dalam keluarga avermectin. Bahan kimia mahal ini sangat berkesan terhadap banyak spesies nematod dan dianggap selamat dari segi alam sekitar9. Walau bagaimanapun, penggunaan berulang nematicides ini dijangka menghasilkan tekanan pemilihan yang hampir pasti akan membawa kepada kemunculan nematod pain tahan, seperti yang telah ditunjukkan untuk beberapa perosak serangga, seperti Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella dan nematod Trichostrongylus colubriformis dan Ostertagia circumcincta yang telah berkembang secara beransur-ansur. avermectins10,11,12. Oleh itu, corak rintangan perlu dikaji secara berkala dan nematisida disaring secara berterusan untuk mencari langkah alternatif, kos efektif dan mesra alam untuk mengawal PVD. Dalam beberapa dekad kebelakangan ini, beberapa pengarang telah mencadangkan penggunaan ekstrak tumbuhan, minyak pati dan bahan meruap sebagai agen kawalan nematod13,14,15,16.
Kami baru-baru ini menunjukkan aktiviti nematicidal indole, molekul isyarat antara sel dan antara kerajaan, dalam Caenorhabditis elegans 17 . Indole ialah isyarat intraselular yang meluas dalam ekologi mikrob, mengawal pelbagai fungsi yang mempengaruhi fisiologi mikrob, pembentukan spora, kestabilan plasmid, rintangan dadah, pembentukan biofilm, dan virulensi 18, 19 . Aktiviti indole dan derivatifnya terhadap nematod patogen lain belum dikaji. Dalam kajian ini, kami menyiasat aktiviti nematicidal 34 indol terhadap nematod pain dan menjelaskan mekanisme tindakan 5-iodoindole yang paling kuat menggunakan mikroskopi, fotografi selang masa, dan eksperimen dok molekul, dan menilai kesan toksiknya pada tumbuhan menggunakan ujian percambahan benih.
Kepekatan tinggi (> 1.0 mM) indole telah dilaporkan sebelum ini mempunyai kesan nematicidal pada nematod17. Selepas rawatan B. xylophilus (peringkat hayat bercampur) dengan indole atau 33 derivatif indole berbeza pada 1 mM, kematian B. xylophilus diukur dengan mengira nematod hidup dan mati dalam kumpulan kawalan dan dirawat. Lima indol mempamerkan aktiviti nematicidal yang ketara; kemandirian kumpulan kawalan yang tidak dirawat adalah 95 ± 7% selepas 24 jam. Daripada 34 indol yang diuji, 5-iodoindole dan 4-fluoroindole pada 1 mM menyebabkan 100% kematian, manakala 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-karboksilat, dan 7-iodoindole menyebabkan kira-kira 50% kematian (Jadual 1).
Kesan 5-iodoindole pada pembentukan vakuol dan metabolisme nematod kayu pain. (A) Kesan avermectin dan 5-iodoindole pada nematod jantan dewasa, (B) telur nematod peringkat L1 dan (C) metabolisme B. xylophilus, (i) vakuol tidak diperhatikan pada 0 jam, rawatan menghasilkan (ii) vakuol, (iii) pengumpulan berbilang vakuol, (iv) gabungan vakuol, (iv) (vi) pembentukan vakuol gergasi. Anak panah merah menunjukkan pembengkakan vakuol, anak panah biru menunjukkan gabungan vakuol dan anak panah hitam menunjukkan vakuol gergasi. Bar skala = 50 μm.
Di samping itu, kajian ini juga menerangkan proses berurutan kematian akibat metana dalam nematod pain (Rajah 4C). Kematian metanogenik ialah jenis kematian sel bukan apoptosis yang dikaitkan dengan pengumpulan vakuol sitoplasma yang menonjol27. Kecacatan morfologi yang diperhatikan dalam nematod pain nampaknya berkait rapat dengan mekanisme kematian akibat metana. Pemeriksaan mikroskopik pada masa yang berbeza menunjukkan bahawa vakuol gergasi terbentuk selepas 20 jam pendedahan kepada 5-iodoindole (0.1 mM). Vakuol mikroskopik diperhatikan selepas 8 jam rawatan, dan bilangannya meningkat selepas 12 jam. Beberapa vakuol besar diperhatikan selepas 14 jam. Beberapa vakuol bercantum jelas kelihatan selepas 12-16 jam rawatan, menunjukkan bahawa gabungan vakuol adalah asas mekanisme kematian metanogenik. Selepas 20 jam, beberapa vakuol gergasi ditemui di seluruh cacing. Pemerhatian ini mewakili laporan pertama keluarosis dalam C. elegans.
Dalam cacing yang dirawat 5-iodoindole, pengagregatan dan pecah vakuol juga diperhatikan (Rajah 5), seperti yang dibuktikan oleh lenturan cacing dan pembebasan vakuol ke persekitaran. Gangguan vakuol juga diperhatikan dalam membran kulit telur, yang biasanya dipelihara utuh oleh L2 semasa penetasan (Tambahan Rajah S2). Pemerhatian ini menyokong penglibatan pengumpulan cecair dan kegagalan osmoregulasi, serta kecederaan sel boleh balik (RCI), dalam proses pembentukan dan suppurasi vakuol (Rajah 5).
Menghipotesiskan peranan iodin dalam pembentukan vakuol yang diperhatikan, kami menyiasat aktiviti nematicidal natrium iodida (NaI) dan kalium iodida (KI). Walau bagaimanapun, pada kepekatan (0.1, 0.5 atau 1 mM), mereka tidak menjejaskan sama ada kemandirian nematod atau pembentukan vakuol (Tambahan Rajah S5), walaupun 1 mM KI mempunyai sedikit kesan nematicidal. Sebaliknya, 7-iodoindole (1 atau 2 mM), seperti 5-iodoindole, mendorong berbilang vakuol dan ubah bentuk struktur (Tambahan Rajah S6). Kedua-dua iodoindoles menunjukkan ciri fenotip yang sama dalam nematod pain, manakala NaI dan KI tidak. Menariknya, indole tidak mendorong pembentukan vakuol dalam B. xylophilus pada kepekatan yang diuji (data tidak ditunjukkan). Oleh itu, keputusan mengesahkan bahawa kompleks indole-iodin bertanggungjawab untuk vakuolisasi dan metabolisme B. xylophilus.
Antara indol yang diuji untuk aktiviti nematicidal, 5-iodoindole mempunyai indeks gelincir tertinggi iaitu -5.89 kcal/mol, diikuti oleh 7-iodoindole (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4.33), dan indole (-4.03) (Rajah 6). Ikatan hidrogen tulang belakang yang kuat 5-iodoindole kepada leucine 218 menstabilkan pengikatannya, manakala semua derivatif indole lain mengikat serin 260 melalui ikatan hidrogen rantai sisi. Antara iodoindoles model lain, 2-iodoindole mempunyai nilai pengikatan -5.248 kcal/mol, yang disebabkan oleh ikatan hidrogen utamanya dengan leucine 218. Pengikatan lain yang diketahui termasuk 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4.0 kcal/mol), dan 6-2. S8). Kebanyakan indole dan indole terhalogen itu sendiri, kecuali 5-iodoindole dan 2-iodoindole, membentuk ikatan dengan serine 260. Fakta bahawa ikatan hidrogen dengan leucine 218 menunjukkan pengikatan ligan reseptor yang cekap, seperti yang diperhatikan untuk ivermectin (Tambahan Rajah S7), mengesahkan bahawa 5-indoletin-iodole, seperti indoletin2-iodole mengikat ketat pada tapak aktif reseptor GluCL melalui leucine 218 (Rajah 6 dan Rajah Tambahan S8). Kami mencadangkan bahawa pengikatan ini diperlukan untuk mengekalkan struktur liang terbuka kompleks GluCL dan dengan mengikat ketat pada tapak aktif reseptor GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin dan ivermectin dengan itu mengekalkan saluran ion terbuka dan membenarkan pengambilan cecair.
Docking molekul indole dan indole terhalogen kepada GluCL. Orientasi mengikat (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, dan (D) ligan 5-iodoindole ke tapak aktif GluCL. Protein diwakili oleh reben, dan ikatan hidrogen tulang belakang ditunjukkan sebagai garis putus-putus kuning. (A′), (B′), (C′), dan (D′) menunjukkan interaksi ligan yang sepadan dengan sisa asid amino di sekeliling, dan ikatan hidrogen rantai sisi ditunjukkan oleh anak panah bertitik merah jambu.
Eksperimen telah dijalankan untuk menilai kesan toksik 5-iodoindole terhadap percambahan benih kubis dan lobak. 5-iodoindole (0.05 atau 0.1 mM) atau avermectin (10 μg/mL) mempunyai sedikit atau tiada kesan pada percambahan awal dan kemunculan plantlet (Rajah 7). Di samping itu, tiada perbezaan ketara ditemui antara kadar percambahan kawalan yang tidak dirawat dan benih yang dirawat dengan 5-iodoindole atau avermectin. Kesan ke atas pemanjangan akar tunjang dan bilangan akar sisi yang terbentuk adalah tidak ketara, walaupun 1 mM (10 kali ganda kepekatan aktifnya) 5-iodoindole sedikit melambatkan perkembangan akar sisi. Keputusan ini menunjukkan bahawa 5-iodoindole tidak toksik kepada sel tumbuhan dan tidak mengganggu proses pembangunan tumbuhan pada kepekatan yang dikaji.
Kesan 5-iodoindole pada percambahan biji benih. Percambahan, percambahan dan pengakaran sisi benih B. oleracea dan R. raphanistrum pada medium agar Murashige dan Skoog dengan atau tanpa avermectin atau 5-iodoindole. Percambahan direkodkan selepas 3 hari pengeraman pada suhu 22°C.
Kajian ini melaporkan beberapa kes pembunuhan nematod oleh indol. Yang penting, ini adalah laporan pertama metilasi iodoindole (suatu proses yang disebabkan oleh pengumpulan vakuol kecil yang secara beransur-ansur bergabung menjadi vakuol gergasi, akhirnya membawa kepada pecah membran dan kematian) dalam jarum pain, dengan iodoindole mempamerkan sifat nematid yang ketara serupa dengan nematid komersial avermectin.
Indoles sebelum ini telah dilaporkan menggunakan pelbagai fungsi isyarat dalam prokariot dan eukariota, termasuk perencatan/pembentukan biofilm, kemandirian bakteria, dan patogenik19,32,33,34. Baru-baru ini, potensi kesan terapeutik indole terhalogen, alkaloid indole, dan derivatif indole semisintetik telah menarik minat penyelidikan yang meluas35,36,37. Sebagai contoh, indol terhalogen telah ditunjukkan untuk membunuh sel Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang berterusan37. Di samping itu, adalah menjadi kepentingan saintifik untuk mengkaji keberkesanan indole terhalogen terhadap spesies, genera dan kerajaan lain, dan kajian ini adalah satu langkah ke arah mencapai matlamat ini.
Di sini, kami mencadangkan satu mekanisme untuk kematian akibat 5-iodoindole dalam C. elegans berdasarkan kecederaan sel boleh balik (RCI) dan metilasi (Rajah 4C dan 5). Perubahan edema seperti bengkak dan degenerasi vakuolar adalah penunjuk RCI dan metilasi, ditunjukkan sebagai vakuol gergasi dalam sitoplasma48,49. RCI mengganggu pengeluaran tenaga dengan mengurangkan pengeluaran ATP, menyebabkan kegagalan pam ATPase, atau mengganggu membran sel dan menyebabkan kemasukan pesat Na+, Ca2+ dan air50,51,52. Vakuol intracytoplasmic timbul dalam sel haiwan akibat pengumpulan cecair dalam sitoplasma akibat kemasukan Ca2+ dan air53. Menariknya, mekanisme kerosakan sel ini boleh diterbalikkan jika kerosakan itu bersifat sementara dan sel mula menghasilkan ATP untuk jangka masa tertentu, tetapi jika kerosakan berterusan atau bertambah teruk, sel-sel itu mati.54 Pemerhatian kami menunjukkan bahawa nematod yang dirawat dengan 5-iodoindole tidak dapat memulihkan biosintesis normal selepas terdedah kepada keadaan tekanan.
Fenotip metilasi yang disebabkan oleh 5-iodoindole dalam B. xylophilus mungkin disebabkan oleh kehadiran iodin dan taburan molekulnya, kerana 7-iodoindole mempunyai kesan perencatan yang kurang pada B. xylophilus daripada 5-iodoindole (Jadual 1 dan Rajah Tambahan S6). Keputusan ini sebahagiannya konsisten dengan kajian Maltese et al. (2014), yang melaporkan bahawa translokasi bahagian nitrogen piridil dalam indole dari para- kepada kedudukan meta menghapuskan vakuolisasi, perencatan pertumbuhan, dan sitotoksisiti dalam sel U251, menunjukkan bahawa interaksi molekul dengan tapak aktif tertentu dalam protein adalah kritikal27,44,45. Interaksi antara indole atau indole terhalogen dan reseptor GluCL yang diperhatikan dalam kajian ini juga menyokong tanggapan ini, kerana 5- dan 2-iodoindole didapati mengikat kepada reseptor GluCL dengan lebih kuat daripada indole lain yang diperiksa (Rajah 6 dan Rajah Tambahan S8). Iodin pada kedudukan kedua atau kelima indole didapati mengikat leucine 218 reseptor GluCL melalui ikatan hidrogen tulang belakang, manakala indole terhalogen lain dan indole sendiri membentuk ikatan hidrogen rantai sisi yang lemah dengan serine 260 (Rajah 6). Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa penyetempatan halogen memainkan peranan penting dalam induksi degenerasi vakuolar, manakala pengikatan ketat 5-iodoindole memastikan saluran ion terbuka, dengan itu membolehkan kemasukan cecair yang cepat dan pecah vakuol. Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan terperinci 5-iodoindole masih perlu ditentukan.
Sebelum penggunaan praktikal 5-iodoindole, kesan toksiknya pada tumbuhan perlu dianalisis. Eksperimen percambahan biji benih kami menunjukkan bahawa 5-iodoindole tidak mempunyai kesan negatif terhadap percambahan biji benih atau proses pembangunan seterusnya pada kepekatan yang dikaji (Rajah 7). Oleh itu, kajian ini memberi asas kepada penggunaan 5-iodoindole dalam persekitaran ekologi untuk mengawal kemudaratan nematod pain kepada pokok pain.
Laporan terdahulu telah menunjukkan bahawa terapi berasaskan indole mewakili pendekatan yang berpotensi untuk menangani masalah rintangan antibiotik dan perkembangan kanser55. Di samping itu, indole mempunyai aktiviti antibakteria, antikanser, antioksidan, anti-radang, antidiabetik, antivirus, antiproliferatif dan antituberkulosis dan boleh berfungsi sebagai asas yang menjanjikan untuk pembangunan ubat56,57. Kajian ini mencadangkan buat pertama kalinya potensi penggunaan iodin sebagai agen antiparasit dan anthelmintik.
Avermectin ditemui tiga dekad yang lalu dan memenangi Hadiah Nobel pada 2015, dan penggunaannya sebagai anthelmintik masih aktif. Walau bagaimanapun, disebabkan perkembangan pesat rintangan terhadap avermectins dalam nematod dan serangga perosak, strategi alternatif, kos rendah, dan mesra alam diperlukan untuk mengawal jangkitan PWN pada pokok pain. Kajian ini juga melaporkan mekanisme di mana 5-iodoindole membunuh nematod pain dan 5-iodoindole mempunyai ketoksikan yang rendah kepada sel tumbuhan, yang membuka prospek yang baik untuk aplikasi komersial masa depannya.
Semua eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Universiti Yeungnam, Gyeongsan, Korea, dan kaedah telah dilakukan mengikut garis panduan Jawatankuasa Etika Universiti Yeungnam.
Eksperimen pengeraman telur dilakukan menggunakan prosedur yang telah ditetapkan43. Untuk menilai kadar penetasan (HR), nematoda dewasa berumur 1 hari (kira-kira 100 ekor betina dan 100 ekor jantan) dipindahkan ke dalam cawan Petri yang mengandungi kulat dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam. Telur kemudiannya diasingkan dan dirawat dengan 5-iodoindole (0.05 mM dan 0.1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) sebagai penggantungan dalam air suling steril. Suspensi ini (500 μl; kira-kira 100 telur) telah dipindahkan ke telaga plat kultur tisu 24-telaga dan diinkubasi pada 22 ° C. Kiraan L2 dibuat selepas 24 jam pengeraman tetapi dianggap mati jika sel tidak bergerak apabila dirangsang dengan wayar platinum halus. Eksperimen ini dijalankan dalam dua peringkat, setiap satu dengan enam ulangan. Data daripada kedua-dua eksperimen telah digabungkan dan dibentangkan. Peratusan HR dikira seperti berikut:
Kematian larva dinilai menggunakan prosedur yang dibangunkan sebelum ini. Telur nematod dikumpul dan embrio disegerakkan dengan menetas dalam air suling steril untuk menghasilkan larva peringkat L2. Larva yang disegerakkan (kira-kira 500 nematod) dirawat dengan 5-iodoindole (0.05 mM dan 0.1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) dan diternak pada plat B. cinerea Petri. Selepas 48 jam pengeraman pada 22 ° C, nematod dikumpulkan dalam air suling steril dan diperiksa untuk kehadiran peringkat L2, L3, dan L4. Kehadiran peringkat L3 dan L4 menunjukkan transformasi larva, manakala kehadiran peringkat L2 menunjukkan tiada transformasi. Imej diperoleh menggunakan Sistem Pengimejan Sel Digital iRiS™. Eksperimen ini dijalankan dalam dua peringkat, setiap satu dengan enam ulangan. Data daripada kedua-dua eksperimen telah digabungkan dan dibentangkan.
Ketoksikan 5-iodoindole dan avermectin kepada biji benih dinilai menggunakan ujian percambahan pada plat agar Murashige dan Skoog.62 Biji benih B. oleracea dan R. raphanistrum pertama kali direndam dalam air suling steril selama satu hari, dicuci dengan 1 ml 100% etanol, setiap satu disterilkan dengan 1 ml natrium klor 50% komersil. min, dan dibasuh lima kali dengan 1 ml air steril. Biji benih yang telah disterilkan kemudiannya ditekan pada plat agar percambahan yang mengandungi 0.86 g/l (0.2X) medium Murashige dan Skoog dan 0.7% agar bakteriologi dengan atau tanpa 5-iodoindole atau avermectin. Plat kemudian diinkubasi pada 22 ° C, dan imej diambil selepas 3 hari pengeraman. Eksperimen ini dijalankan dalam dua peringkat, setiap satu mempunyai enam ulangan.
Masa siaran: Feb-26-2025