Nematod pain ialah endoparasit migrasi kuarantin yang diketahui menyebabkan kerugian ekonomi yang teruk dalam ekosistem hutan pain. Kajian ini mengkaji aktiviti nematisida indol terhalogen terhadap nematod pain dan mekanisme tindakannya. Aktiviti nematisida 5-iodoindole dan avermectin (kawalan positif) terhadap nematod pain adalah serupa dan tinggi pada kepekatan rendah (10 μg/mL). 5-iodoindole mengurangkan fekunditi, aktiviti pembiakan, kematian embrio dan larva, dan tingkah laku lokomotor. Interaksi molekul ligan dengan reseptor saluran klorida berpagar glutamat khusus invertebrata menyokong tanggapan bahawa 5-iodoindole, seperti avermectin, mengikat rapat pada tapak aktif reseptor. 5-Iodoindole juga mendorong pelbagai ubah bentuk fenotip dalam nematod, termasuk keruntuhan/pengecutan organ yang tidak normal dan peningkatan vakuolisasi. Keputusan ini menunjukkan bahawa vakuol mungkin memainkan peranan dalam kematian yang dimediasi oleh metilasi nematod. Yang penting, 5-iodoindole tidak toksik kepada kedua-dua spesies tumbuhan (kubis dan lobak). Oleh itu, kajian ini menunjukkan bahawa penggunaan iodoindole di bawah keadaan persekitaran dapat mengawal kecederaan layu pain.
Nematod kayu pain (Bursaphelenchus xylophilus) tergolong dalam nematod kayu pain (PWN), nematod endoparasit migrasi yang diketahui menyebabkan kerosakan ekologi yang teruk kepada ekosistem hutan pain1. Penyakit layu pain (PWD) yang disebabkan oleh nematod kayu pain menjadi masalah serius di beberapa benua, termasuk Asia dan Eropah, dan di Amerika Utara, nematod memusnahkan spesies pain yang diperkenalkan1,2. Kemerosotan pokok pain merupakan masalah ekonomi utama, dan prospek penyebarannya di seluruh dunia adalah membimbangkan3. Spesies pain berikut paling kerap diserang oleh nematod: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, dan Pinus radiata4. Nematod pain ialah penyakit serius yang boleh membunuh pokok pain dalam beberapa minggu atau bulan selepas jangkitan. Di samping itu, wabak nematod pain adalah perkara biasa dalam pelbagai ekosistem, jadi rantaian jangkitan berterusan telah diwujudkan1.
Bursaphelenchus xylophilus ialah nematod parasit tumbuhan kuarantin yang tergolong dalam superfamili Aphelenchoidea dan klad 102.5. Nematod ini memakan kulat dan membiak dalam tisu kayu pokok pain, berkembang menjadi empat peringkat larva yang berbeza: L1, L2, L3, L4 dan individu dewasa1,6. Di bawah keadaan kekurangan makanan, nematod pain beralih ke peringkat larva khusus – dauer, yang menjadi parasit vektornya – kumbang kulit kayu pain (Monochamus alternatus) dan dipindahkan ke pokok pain yang sihat. Dalam perumah yang sihat, nematod dengan cepat berhijrah melalui tisu tumbuhan dan memakan sel parenkim, yang membawa kepada beberapa reaksi hipersensitiviti, layu pain dan kematian dalam tempoh setahun selepas jangkitan1,7,8.
Kawalan biologi nematod pain telah lama menjadi satu cabaran, dengan langkah-langkah kuarantin bermula sejak abad ke-20. Strategi semasa untuk mengawal nematod pain terutamanya melibatkan rawatan kimia, termasuk pengasapan kayu dan penanaman nematisida ke dalam batang pokok. Nematisida yang paling biasa digunakan ialah avermectin dan avermectin benzoat, yang tergolong dalam keluarga avermectin. Bahan kimia mahal ini sangat berkesan terhadap banyak spesies nematod dan dianggap selamat untuk alam sekitar9. Walau bagaimanapun, penggunaan nematisida ini secara berulang dijangka akan mewujudkan tekanan pemilihan yang hampir pasti akan membawa kepada kemunculan nematod pain yang tahan, seperti yang telah ditunjukkan untuk beberapa serangga perosak, seperti Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella dan nematoda Trichostrongylus colubriformis dan Ostertagia circumcincta, yang secara beransur-ansur telah membentuk rintangan terhadap avermectin10,11,12. Oleh itu, corak rintangan perlu dikaji secara berkala dan nematisida ditapis secara berterusan untuk mencari langkah alternatif, kos efektif dan mesra alam untuk mengawal PVD. Dalam beberapa dekad kebelakangan ini, beberapa penulis telah mencadangkan penggunaan ekstrak tumbuhan, minyak pati dan bahan meruap sebagai agen kawalan nematod13,14,15,16.
Baru-baru ini kami menunjukkan aktiviti nematisida indol, molekul isyarat antara sel dan antara kerajaan, dalam Caenorhabditis elegans 17. Indol ialah isyarat intrasel yang meluas dalam ekologi mikrob, mengawal pelbagai fungsi yang mempengaruhi fisiologi mikrob, pembentukan spora, kestabilan plasmid, rintangan ubat, pembentukan biofilm dan virulensi 18, 19. Aktiviti indol dan derivatifnya terhadap nematod patogen lain belum dikaji. Dalam kajian ini, kami menyiasat aktiviti nematisida 34 indol terhadap nematod pain dan menjelaskan mekanisme tindakan 5-iodoindole yang paling kuat menggunakan mikroskopi, fotografi selang masa dan eksperimen dok molekul, dan menilai kesan toksiknya pada tumbuhan menggunakan ujian percambahan biji benih.
Kepekatan indol yang tinggi (>1.0 mM) telah dilaporkan sebelum ini mempunyai kesan nematisida pada nematod17. Selepas rawatan B. xylophilus (peringkat hidup campuran) dengan indol atau 33 derivatif indol yang berbeza pada 1 mM, kematian B. xylophilus diukur dengan mengira nematod hidup dan mati dalam kumpulan kawalan dan kumpulan yang dirawat. Lima indol mempamerkan aktiviti nematisida yang ketara; kemandirian kumpulan kawalan yang tidak dirawat adalah 95 ± 7% selepas 24 jam. Daripada 34 indol yang diuji, 5-iodoindole dan 4-fluoroindole pada 1 mM menyebabkan kematian 100%, manakala 5,6-difluoroindigo, metilindole-7-karboksilat, dan 7-iodoindole menyebabkan kematian kira-kira 50% (Jadual 1).
Kesan 5-iodoindole terhadap pembentukan vakuol dan metabolisme nematod kayu pain. (A) Kesan avermectin dan 5-iodoindole terhadap nematod jantan dewasa, (B) telur nematod peringkat L1 dan (C) metabolisme B. xylophilus, (i) vakuol tidak diperhatikan pada 0 jam, rawatan menghasilkan (ii) vakuol, (iii) pengumpulan berbilang vakuol, (iv) pembengkakan vakuol, (v) gabungan vakuol dan (vi) pembentukan vakuol gergasi. Anak panah merah menunjukkan pembengkakan vakuol, anak panah biru menunjukkan gabungan vakuol dan anak panah hitam menunjukkan vakuol gergasi. Bar skala = 50 μm.
Di samping itu, kajian ini juga menerangkan proses berjujukan kematian akibat metana dalam nematod pain (Rajah 4C). Kematian metanogenik adalah jenis kematian sel bukan apoptosis yang dikaitkan dengan pengumpulan vakuol sitoplasma yang menonjol27. Kecacatan morfologi yang diperhatikan dalam nematod pain nampaknya berkait rapat dengan mekanisme kematian akibat metana. Pemeriksaan mikroskopik pada masa yang berbeza menunjukkan bahawa vakuol gergasi terbentuk selepas 20 jam pendedahan kepada 5-iodoindole (0.1 mM). Vakuol mikroskopik diperhatikan selepas 8 jam rawatan, dan bilangannya meningkat selepas 12 jam. Beberapa vakuol besar diperhatikan selepas 14 jam. Beberapa vakuol yang terlakur jelas kelihatan selepas 12–16 jam rawatan, menunjukkan bahawa gabungan vakuol adalah asas mekanisme kematian metanogenik. Selepas 20 jam, beberapa vakuol gergasi ditemui di seluruh cacing. Pemerhatian ini mewakili laporan pertama metuosis dalam C. elegans.
Dalam cacing yang dirawat dengan 5-iodoindole, pengagregatan dan pecahan vakuol juga diperhatikan (Rajah 5), seperti yang dibuktikan oleh lenturan cacing dan pembebasan vakuol ke persekitaran. Gangguan vakuol juga diperhatikan dalam membran kulit telur, yang biasanya dipelihara utuh oleh L2 semasa penetasan (Rajah Tambahan S2). Pemerhatian ini menyokong penglibatan pengumpulan cecair dan kegagalan osmoregulasi, serta kecederaan sel boleh balik (RCI), dalam proses pembentukan dan supurasi vakuol (Rajah 5).
Dengan membuat hipotesis tentang peranan iodin dalam pembentukan vakuol yang diperhatikan, kami mengkaji aktiviti nematisida natrium iodida (NaI) dan kalium iodida (KI). Walau bagaimanapun, pada kepekatan (0.1, 0.5 atau 1 mM), ia tidak menjejaskan sama ada kemandirian nematod atau pembentukan vakuol (Rajah Tambahan S5), walaupun 1 mM KI mempunyai sedikit kesan nematisida. Sebaliknya, 7-iodoindole (1 atau 2 mM), seperti 5-iodoindole, mendorong pelbagai vakuol dan ubah bentuk struktur (Rajah Tambahan S6). Kedua-dua iodoindole menunjukkan ciri-ciri fenotip yang serupa dalam nematod pain, manakala NaI dan KI tidak. Menariknya, indole tidak mendorong pembentukan vakuol dalam B. xylophilus pada kepekatan yang diuji (data tidak ditunjukkan). Oleh itu, keputusan mengesahkan bahawa kompleks indole-iodin bertanggungjawab untuk vakuolisasi dan metabolisme B. xylophilus.
Antara indol yang diuji untuk aktiviti nematisida, 5-iodoindole mempunyai indeks gelinciran tertinggi iaitu -5.89 kcal/mol, diikuti oleh 7-iodoindole (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindole (-4.33), dan indol (-4.03) (Rajah 6). Ikatan hidrogen tulang belakang yang kuat bagi 5-iodoindole kepada leusin 218 menstabilkan pengikatannya, manakala semua derivatif indol lain mengikat kepada serina 260 melalui ikatan hidrogen rantai sisi. Antara iodoindole model lain, 2-iodoindole mempunyai nilai pengikatan sebanyak -5.248 kcal/mol, yang disebabkan oleh ikatan hidrogen utamanya dengan leusin 218. Pengikatan lain yang diketahui termasuk 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4.0 kcal/mol), dan 6-fluoroindole (-2.6 kcal/mol) (Rajah Tambahan S8). Kebanyakan indol terhalogen dan indol itu sendiri, kecuali 5-iodoindole dan 2-iodoindole, membentuk ikatan dengan serina 260. Hakikat bahawa ikatan hidrogen dengan leusin 218 menunjukkan pengikatan reseptor-ligan yang cekap, seperti yang diperhatikan untuk ivermectin (Rajah Tambahan S7), mengesahkan bahawa 5-iodoindole dan 2-iodoindole, seperti ivermectin, mengikat rapat pada tapak aktif reseptor GluCL melalui leusin 218 (Rajah 6 dan Rajah Tambahan S8). Kami mencadangkan bahawa pengikatan ini diperlukan untuk mengekalkan struktur liang terbuka kompleks GluCL dan dengan mengikat rapat pada tapak aktif reseptor GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin dan ivermectin, seterusnya mengekalkan saluran ion terbuka dan membolehkan pengambilan cecair.
Docking molekul indol dan indol terhalogen kepada GluCL. Orientasi pengikatan ligan (A) indol, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, dan (D) 5-iodoindole kepada tapak aktif GluCL. Protein diwakili oleh reben, dan ikatan hidrogen tulang belakang ditunjukkan sebagai garis putus-putus kuning. (A′), (B′), (C′), dan (D′) menunjukkan interaksi ligan yang sepadan dengan residu asid amino di sekelilingnya, dan ikatan hidrogen rantai sisi ditunjukkan oleh anak panah putus-putus merah jambu.
Eksperimen telah dijalankan untuk menilai kesan toksik 5-iodoindole terhadap percambahan biji kubis dan lobak. 5-iodoindole (0.05 atau 0.1 mM) atau avermectin (10 μg/mL) mempunyai sedikit atau tiada kesan terhadap percambahan awal dan kemunculan anak pokok (Rajah 7). Di samping itu, tiada perbezaan ketara ditemui antara kadar percambahan kawalan yang tidak dirawat dan biji benih yang dirawat dengan 5-iodoindole atau avermectin. Kesan terhadap pemanjangan akar tunjang dan bilangan akar sisi yang terbentuk adalah tidak ketara, walaupun 1 mM (10 kali ganda kepekatan aktifnya) 5-iodoindole sedikit melambatkan perkembangan akar sisi. Keputusan ini menunjukkan bahawa 5-iodoindole tidak toksik kepada sel tumbuhan dan tidak mengganggu proses perkembangan tumbuhan pada kepekatan yang dikaji.
Kesan 5-iodoindole terhadap percambahan biji benih. Percambahan, percambahan dan perakaran lateral biji benih B. oleracea dan R. raphanistrum pada medium agar Murashige dan Skoog dengan atau tanpa avermectin atau 5-iodoindole. Percambahan direkodkan selepas 3 hari pengeraman pada suhu 22°C.
Kajian ini melaporkan beberapa kes pembunuhan nematod oleh indol. Yang penting, ini merupakan laporan pertama tentang metilasi yang mendorong iodoindole (satu proses yang disebabkan oleh pengumpulan vakuol kecil yang secara beransur-ansur bergabung menjadi vakuol gergasi, akhirnya menyebabkan membran pecah dan kematian) dalam jarum pain, dengan iodoindole mempamerkan sifat nematisida yang ketara serupa dengan nematisida komersial avermectin.
Indol sebelum ini dilaporkan mempunyai pelbagai fungsi isyarat dalam prokariot dan eukariot, termasuk perencatan/pembentukan biofilm, kemandirian bakteria, dan patogenisiti19,32,33,34. Baru-baru ini, potensi kesan terapeutik indole terhalogen, alkaloid indole, dan derivatif indole separa sintetik telah menarik minat penyelidikan yang meluas35,36,37. Contohnya, indole terhalogen telah terbukti membunuh sel Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang berterusan37. Di samping itu, adalah penting untuk mengkaji keberkesanan indole terhalogen terhadap spesies, genera, dan kerajaan lain, dan kajian ini merupakan langkah ke arah mencapai matlamat ini.
Di sini, kami mencadangkan satu mekanisme untuk kematian akibat 5-iodoindole dalam C. elegans berdasarkan kecederaan sel boleh balik (RCI) dan metilasi (Rajah 4C dan 5). Perubahan edema seperti bengkak dan degenerasi vakuolar adalah petunjuk RCI dan metilasi, yang ditunjukkan sebagai vakuol gergasi dalam sitoplasma48,49. RCI mengganggu pengeluaran tenaga dengan mengurangkan pengeluaran ATP, menyebabkan kegagalan pam ATPase, atau mengganggu membran sel dan menyebabkan kemasukan Na+, Ca2+, dan air yang cepat50,51,52. Vakuol intrasitoplasma timbul dalam sel haiwan akibat pengumpulan cecair dalam sitoplasma akibat kemasukan Ca2+ dan air53. Menariknya, mekanisme kerosakan sel ini boleh balik jika kerosakan itu sementara dan sel mula menghasilkan ATP untuk tempoh masa tertentu, tetapi jika kerosakan itu berterusan atau bertambah buruk, sel-sel mati.54 Pemerhatian kami menunjukkan bahawa nematod yang dirawat dengan 5-iodoindole tidak dapat memulihkan biosintesis normal selepas terdedah kepada keadaan tekanan.
Fenotip metilasi yang diinduksi oleh 5-iodoindole dalam B. xylophilus mungkin disebabkan oleh kehadiran iodin dan taburan molekulnya, memandangkan 7-iodoindole mempunyai kesan perencatan yang kurang pada B. xylophilus berbanding 5-iodoindole (Jadual 1 dan Rajah Tambahan S6). Keputusan ini sebahagiannya konsisten dengan kajian Maltese et al. (2014), yang melaporkan bahawa translokasi bahagian piridil nitrogen dalam indole dari kedudukan para-ke-meta menghapuskan vakuolisasi, perencatan pertumbuhan, dan sitotoksisiti dalam sel U251, menunjukkan bahawa interaksi molekul dengan tapak aktif tertentu dalam protein adalah kritikal27,44,45. Interaksi antara indole atau indole terhalogen dan reseptor GluCL yang diperhatikan dalam kajian ini juga menyokong tanggapan ini, kerana 5- dan 2-iodoindole didapati mengikat reseptor GluCL lebih kuat daripada indole lain yang diperiksa (Rajah 6 dan Rajah Tambahan S8). Iodin pada kedudukan kedua atau kelima indol didapati mengikat leusin 218 reseptor GluCL melalui ikatan hidrogen tulang belakang, manakala indol terhalogen lain dan indol itu sendiri membentuk ikatan hidrogen rantai sisi yang lemah dengan serina 260 (Rajah 6). Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa penyetempatan halogen memainkan peranan penting dalam induksi degenerasi vakuolar, manakala pengikatan ketat 5-iodoindole memastikan saluran ion terbuka, sekali gus membolehkan kemasukan bendalir yang cepat dan pecahnya vakuol. Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan terperinci 5-iodoindole masih belum ditentukan.
Sebelum aplikasi praktikal 5-iodoindole, kesan toksiknya terhadap tumbuhan perlu dianalisis. Eksperimen percambahan biji benih kami menunjukkan bahawa 5-iodoindole tidak mempunyai kesan negatif terhadap percambahan biji benih atau proses perkembangan seterusnya pada kepekatan yang dikaji (Rajah 7). Oleh itu, kajian ini menyediakan asas untuk penggunaan 5-iodoindole dalam persekitaran ekologi untuk mengawal bahaya nematod pain terhadap pokok pain.
Laporan terdahulu telah menunjukkan bahawa terapi berasaskan indol mewakili pendekatan yang berpotensi untuk menangani masalah rintangan antibiotik dan perkembangan kanser55. Di samping itu, indol mempunyai aktiviti antibakteria, antikanser, antioksidan, anti-radang, antidiabetes, antivirus, antiproliferatif dan antituberkulosis dan boleh berfungsi sebagai asas yang menjanjikan untuk pembangunan ubat56,57. Kajian ini buat pertama kalinya mencadangkan potensi penggunaan iodin sebagai agen antiparasit dan anthelmintik.
Avermectin telah ditemui tiga dekad yang lalu dan memenangi Hadiah Nobel pada tahun 2015, dan penggunaannya sebagai anthelmintik masih berterusan secara aktif. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh perkembangan pesat rintangan terhadap avermectin dalam nematod dan serangga perosak, strategi alternatif, kos rendah dan mesra alam diperlukan untuk mengawal jangkitan PWN dalam pokok pain. Kajian ini juga melaporkan mekanisme 5-iodoindole membunuh nematod pain dan 5-iodoindole mempunyai ketoksikan yang rendah terhadap sel tumbuhan, yang membuka prospek yang baik untuk aplikasi komersialnya pada masa hadapan.
Semua eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Universiti Yeungnam, Gyeongsan, Korea, dan kaedah tersebut telah dijalankan mengikut garis panduan Jawatankuasa Etika Universiti Yeungnam.
Eksperimen pengeraman telur telah dijalankan menggunakan prosedur yang telah ditetapkan43. Untuk menilai kadar penetasan (HR), nematod dewasa berusia 1 hari (kira-kira 100 betina dan 100 jantan) dipindahkan ke piring Petri yang mengandungi kulat dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam. Telur kemudiannya diasingkan dan dirawat dengan 5-iodoindole (0.05 mM dan 0.1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) sebagai suspensi dalam air suling steril. Suspensi ini (500 μl; kira-kira 100 telur) dipindahkan ke telaga plat kultur tisu 24-telaga dan diinkubasi pada suhu 22 °C. Kiraan L2 dibuat selepas 24 jam pengeraman tetapi dianggap mati jika sel tidak bergerak apabila dirangsang dengan dawai platinum halus. Eksperimen ini dijalankan dalam dua peringkat, setiap satu dengan enam ulangan. Data daripada kedua-dua eksperimen digabungkan dan dibentangkan. Peratusan HR dikira seperti berikut:
Kematian larva dinilai menggunakan prosedur yang telah dibangunkan sebelum ini. Telur nematod dikumpulkan dan embrio disegerakkan dengan menetas dalam air suling steril untuk menghasilkan larva peringkat L2. Larva yang disegerakkan (kira-kira 500 nematod) dirawat dengan 5-iodoindole (0.05 mM dan 0.1 mM) atau avermectin (10 μg/ml) dan dipelihara pada plat Petri B. cinerea. Selepas 48 jam pengeraman pada suhu 22 °C, nematod dikumpulkan dalam air suling steril dan diperiksa untuk kehadiran peringkat L2, L3, dan L4. Kehadiran peringkat L3 dan L4 menunjukkan transformasi larva, manakala kehadiran peringkat L2 menunjukkan tiada transformasi. Imej diperoleh menggunakan Sistem Pengimejan Sel Digital iRiS™. Eksperimen ini dijalankan dalam dua peringkat, setiap satu dengan enam ulangan. Data daripada kedua-dua eksperimen digabungkan dan dibentangkan.
Ketoksikan 5-iodoindole dan avermectin terhadap biji benih telah dinilai menggunakan ujian percambahan pada plat agar Murashige dan Skoog.62 Biji benih B. oleracea dan R. raphanistrum direndam terlebih dahulu dalam air suling steril selama satu hari, dibasuh dengan 1 ml etanol 100%, disterilkan dengan 1 ml peluntur komersial 50% (3% natrium hipoklorit) selama 15 minit, dan dibasuh lima kali dengan 1 ml air steril. Biji benih yang disterilkan kemudiannya ditekan pada plat agar percambahan yang mengandungi 0.86 g/l (0.2X) medium Murashige dan Skoog dan 0.7% agar bakteriologi dengan atau tanpa 5-iodoindole atau avermectin. Plat kemudiannya diinkubasi pada suhu 22 °C, dan imej diambil selepas 3 hari pengeraman. Eksperimen ini dijalankan dalam dua peringkat, setiap satu mempunyai enam ulangan.
Masa siaran: 26 Feb-2025