Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk hasil terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan versi penyemak imbas anda yang lebih baharu (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan tapak tanpa penggayaan atau JavaScript.
Penemuan dan penggunaan produk semulajadi yang bermanfaat dapat membantu meningkatkan kehidupan manusia.Bahan kimia perencatan pertumbuhan tumbuhan digunakan secara meluas sebagai racun herba untuk mengawal rumpai.Disebabkan keperluan untuk menggunakan pelbagai jenis racun herba, terdapat keperluan untuk mengenal pasti sebatian dengan mekanisme tindakan baharu.Dalam kajian ini, kami menemui sebatian N -alkoxypyrrole novel, coumamonamide, daripada Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan mewujudkan proses sintesis lengkap.Melalui ujian aktiviti biologi, kami mendapati bahawa asid urs-monoamic ialah perantara sintetik urs-monoamide dan berpotensiperencat pertumbuhan tumbuhan.Di samping itu, kami telah membangunkan pelbagai derivatif asid urbenonik, termasuk derivatif urbenyloxy (UDA), yang mempunyai aktiviti herbisida yang tinggi tanpa menjejaskan pertumbuhan sel HeLa secara negatif.Kami juga mendapati bahawa derivatif asid urmotonik mengganggu mikrotubul tumbuhan;sebagai tambahan, KAND menjejaskan filamen aktin dan mendorong kematian sel;Kesan pelbagai rupa ini berbeza daripada perencat mikrotubule yang diketahui dan mencadangkan mekanisme tindakan baharu untuk asid ursonik, yang mewakili kelebihan penting dalam pembangunan racun herba baharu.
Penemuan dan aplikasi praktikal produk semula jadi yang berfaedah dan derivatifnya adalah cara untuk meningkatkan kualiti hidup manusia.Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisma, tumbuhan dan serangga telah membawa kepada kemajuan besar dalam bidang perubatan dan pertanian.Banyak ubat antibiotik dan anti-leukemia telah dibangunkan daripada produk semulajadi.Selain itu, pelbagai jenisracun perosak, racun kulat dan racun herba diekstrak daripada produk semulajadi ini untuk digunakan dalam pertanian.Khususnya, racun herba kawalan rumpai adalah alat penting untuk meningkatkan hasil tanaman dalam pertanian moden, dan pelbagai jenis sebatian telah digunakan secara komersial.Beberapa proses selular dalam tumbuhan, seperti fotosintesis, metabolisme asid amino, sintesis dinding sel, pengawalan mitosis, isyarat phytohormone, atau sintesis protein, dianggap sebagai sasaran biasa racun herba.Sebatian yang menghalang fungsi mikrotubul ialah kelas racun herba biasa yang menjejaskan pertumbuhan tumbuhan dengan menjejaskan peraturan mitosis2.
Mikrotubul adalah komponen sitoskeleton dan dipelihara secara meluas dalam sel eukariotik.Heterodimer tubulin terdiri daripada α-tubulin dan β-tubulin yang membentuk protofilamen mikrotubulus linear, dengan 13 protofilamen membentuk struktur silinder.Mikrotubul memainkan pelbagai peranan dalam sel tumbuhan, termasuk menentukan bentuk sel, pembahagian sel, dan pengangkutan intrasel3,4.Sel tumbuhan mengandungi mikrotubul di bawah membran plasma antara fasa, dan mikrotubul kortikal yang dipanggil ini dianggap mengawal organisasi mikrofibril selulosa melalui pengawalan kompleks selulosa sintase4,5.Mikrotubul kortikal sel epidermis akar, yang terdapat dalam zon pemanjangan pesat hujung akar, terletak di sisi, dan mikrotubul selulosa mengikuti mikrotubul ini dan mengehadkan arah pengembangan sel, dengan itu menggalakkan pemanjangan sel anisotropik.Oleh itu, fungsi mikrotubulus berkait rapat dengan morfologi tumbuhan.Penggantian asid amino dalam gen pengekodan tubulin menyebabkan susunan mikrotubulus kortikal condong dan pertumbuhan sebelah kiri atau kanan dalam Arabidopsis 6,7.Begitu juga, mutasi dalam protein berkaitan mikrotubulus yang mengawal dinamik mikrotubule juga boleh membawa kepada pertumbuhan akar yang herot8,9,10,11,12,13.Di samping itu, rawatan dengan racun herba mikrotubulus yang mengganggu seperti disopyramide, juga dikenali sebagai pretilachlor, juga menyebabkan pertumbuhan akar serong sebelah kiri14.Data ini menunjukkan bahawa pengawalseliaan tepat fungsi mikrotubulus adalah penting untuk menentukan arah pertumbuhan tumbuhan.
Pelbagai jenis perencat mikrotubule telah ditemui, dan ubat-ubatan ini telah memberi sumbangan besar kepada penyelidikan sitoskeletal, serta kepada pertanian dan perubatan2.Khususnya, oryzalin, sebatian dinitroaniline, disopyramide, sebatian berkaitan benzamide, dan analognya boleh menghalang fungsi mikrotubule dan dengan itu menghalang pertumbuhan tumbuhan.Oleh itu, ia digunakan secara meluas sebagai racun herba.Walau bagaimanapun, oleh kerana mikrotubul adalah komponen penting dalam sel tumbuhan dan haiwan, kebanyakan perencat mikrotubul adalah sitotoksik kepada kedua-dua jenis sel.Oleh itu, walaupun kegunaannya diiktiraf sebagai racun herba, bilangan agen antimikrotubulu yang terhad digunakan untuk tujuan praktikal.
Streptomyces ialah genus daripada keluarga Streptomyces, yang merangkumi bakteria aerobik, gram-positif, berfilamen dan terkenal dengan keupayaannya untuk menghasilkan pelbagai jenis metabolit sekunder.Oleh itu, ia dianggap sebagai salah satu sumber terpenting bagi produk semula jadi yang aktif secara biologi.Dalam kajian semasa, kami menemui sebatian baharu yang dipanggil coumamonamide, yang telah diasingkan daripada Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan S. werraensis ISP 5486. Menggunakan analisis spektrum dan analisis spektrum penuh, struktur kuumamonamide telah dicirikan dan rangka N-alkoxypyrrole yang unik. telah ditentukan.sintesis.Asid Ursmonic, perantaraan sintetik ursmonoamide dan derivatifnya, didapati menghalang pertumbuhan dan percambahan tumbuhan model popular Arabidopsis thaliana.Dalam kajian perhubungan struktur-aktiviti, kami mendapati bahawa sebatian dengan C9 diubah suai kepada asid ursonik, dipanggil terbitan bukan niloksi asid ursonik (KAND), dengan ketara meningkatkan kesan perencatan pada pertumbuhan dan percambahan.Terutamanya, perencat pertumbuhan tumbuhan yang baru ditemui juga menjejaskan pertumbuhan tembakau dan lumut hati dan tidak sitotoksik kepada bakteria atau sel HeLa.Selain itu, beberapa derivatif asid urmotonik mendorong fenotip akar yang herot, membayangkan bahawa derivatif ini secara langsung atau tidak langsung mempengaruhi mikrotubul.Selaras dengan idea ini, pemerhatian kami terhadap mikrotubul yang dilabel sama ada secara imunohistokimia atau dengan protein pendarfluor menunjukkan bahawa rawatan KAND menyahpolimerisasi mikrotubul.Di samping itu, rawatan dengan derivatif asid kumamotonik mengganggu mikrofilamen aktin.Oleh itu, kami telah menemui perencat pertumbuhan tumbuhan baharu yang mekanisme tindakannya yang unik melibatkan pemusnahan sitoskeleton.
Strain MK493-CF1 telah diasingkan daripada tanah di Shinagawa-ku, Tokyo.Terikan MK493-CF1 membentuk miselium stroma bercabang baik.Urutan separa gen RNA ribosom 16S (1422 bp) telah ditentukan.Strain ini hampir sama dengan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipikal, 99.93%).Berdasarkan keputusan ini, ditentukan bahawa strain ini berkait rapat dengan strain jenis S. werraensis.Oleh itu, kami menamakan sementara strain ini S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T juga menghasilkan sebatian bioaktif yang sama.Memandangkan terdapat sedikit kajian awal untuk mendapatkan produk semula jadi daripada mikroorganisma ini, kajian kimia selanjutnya telah dijalankan.Selepas penanaman S. werraensis MK493-CF1 pada medium barli dengan penapaian keadaan pepejal pada 30°C selama 14 hari, medium tersebut telah diekstrak dengan 50% EtOH.60 ml sampel telah dikeringkan untuk mendapatkan 59.5 mg ekstrak kasar.Ekstrak mentah telah tertakluk kepada HPLC fasa terbalik untuk memberikan N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, dinamakan coumamonamide, 36.0 mg).Jumlah keseluruhan 1 adalah lebih kurang 60% daripada ekstrak mentah.Oleh itu, kami memutuskan untuk mengkaji secara terperinci sifat-sifat kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 ialah serbuk amorfus putih dan spektrometri jisim resolusi tinggi (HRESIMS) mengesahkan C6H8N2O2 (Rajah 1).Serpihan pirol yang digantikan C2 bagi sebatian ini dicirikan oleh δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH dalam spektrum 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) dan δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), dan spektrum 13C NMR menunjukkan kehadiran empat atom karbon sp2.Kehadiran kumpulan amida pada kedudukan C2 dinilai oleh korelasi HMBC daripada proton C-3 kepada karbon karbonil amida pada δC 161.1.Di samping itu, 1 H dan 13 C NMR memuncak pada δH 4.10 (3H, S) dan δC 68.3 menunjukkan kehadiran kumpulan N-metoksi dalam molekul.Walaupun kedudukan kumpulan metoksi yang betul masih belum ditentukan menggunakan analisis spektroskopi seperti spektroskopi perbezaan yang dipertingkatkan dan singkatan Overhauser nuklear (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide menjadi sebatian calon pertama.
Untuk menentukan struktur 1 yang betul, jumlah sintesis telah dilakukan (Rajah 2a).Rawatan 2-aminopyridine 2 yang tersedia secara komersial dengan m-CPBA menghasilkan N-oksida 3 yang sepadan dalam hasil kuantitatif.Selepas 2-aminoazidation 2, tindak balas siklokondensasi yang diterangkan oleh Abramovich telah dijalankan dalam benzena pada 90°C untuk mendapatkan 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 yang dikehendaki dalam gram.Kelajuan 60% (dua peringkat).15,16.Metilasi dan hidrolisis 4 kemudian memberikan asid 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik (disebut "asid kumotonik", 6) dalam hasil yang baik (70%, dua langkah).Akhir sekali, amidasi melalui asid klorida perantaraan 6 menggunakan ammonia berair memberikan Kumamoto amida 1 dalam 98% hasil.Semua data spektrum 1 yang disintesis adalah serupa dengan 1 terpencil, jadi struktur 1 ditentukan;
Sintesis am dan analisis aktiviti biologi urbenamide dan asid urbenik.(a) Jumlah sintesis amida Kumamoto.(b) Anak benih Arabidopsis Columbia (Col) jenis liar berumur tujuh hari ditanam pada plat Murashige dan Skoog (MS) yang mengandungi coumamonamide 6 atau coumamonamide 1 pada kepekatan yang ditunjukkan.Bar skala = 1 cm.
Pertama, kami menilai aktiviti biologi urbenamide dan perantaraannya untuk keupayaan mereka untuk memodulasi pertumbuhan tumbuhan.Kami menambah pelbagai kepekatan ursmonamide 1 atau asid ursmonic 6 kepada medium agar MS dan anak benih Arabidopsis thaliana yang dikultur pada medium ini.Ujian ini menunjukkan bahawa kepekatan tinggi (500 μM) daripada 6 menghalang pertumbuhan akar (Rajah 2b).Seterusnya, kami menghasilkan pelbagai derivatif dengan menggantikan kedudukan N1 6 dan melakukan kajian hubungan struktur-aktiviti ke atasnya (proses sintesis analog diterangkan dalam Maklumat Sokongan (SI)).Anak benih Arabidopsis ditanam pada medium yang mengandungi 50 μM derivatif asid ursonik, dan panjang akar diukur.seperti yang ditunjukkan pada gambar.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3a, b, dan S1, asid coumamo mempunyai panjang rantai alkoksi linear yang berbeza (9, 10, 11, 12, dan 13) atau rantai alkoksi besar (15, 16, dan 17) pada kedudukan N1.Derivatif menunjukkan perencatan ketara pertumbuhan akar.Di samping itu, kami mendapati bahawa penggunaan 200 μM 10, 11, atau 17 menghalang percambahan (Rajah 3c dan S2).
Kajian hubungan struktur-aktiviti amida Kumamoto dan sebatian yang berkaitan.(a) Skema struktur dan sintesis analog.(b) Kuantifikasi panjang akar anak benih berumur 7 hari yang ditanam pada medium MS dengan atau tanpa derivatif kuumamonamide 50 μM.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan perlakuan palsu (ujian t, ms< 0.05).n>18. Data ditunjukkan sebagai min ± SD.nt bermaksud "tidak diuji" kerana lebih daripada 50% benih tidak bercambah.(c) Kuantifikasi kadar percambahan benih yang dirawat yang diinkubasi selama 7 hari dalam medium MS dengan atau tanpa 200 μM coumamonamide dan sebatian yang berkaitan.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan perlakuan palsu (ujian khi kuasa dua).n=96.
Menariknya, penambahan rantai sisi alkil yang lebih panjang daripada C9 mengurangkan aktiviti perencatan, menunjukkan bahawa sebatian berkaitan asid kumamotoik memerlukan rantai sampingan dengan saiz tertentu untuk mempamerkan aktiviti biologinya.
Oleh kerana analisis perhubungan struktur-aktiviti menunjukkan bahawa C9 telah diubah suai kepada asid ursonik dan terbitan bukan niloksi asid ursonik (selepas ini dirujuk sebagai KAND 11) adalah perencat pertumbuhan tumbuhan yang paling berkesan, kami menjalankan pencirian yang lebih terperinci bagi KAND 11. Rawatan Arabidopsis dengan 50 μM KAND 11 hampir sepenuhnya menghalang percambahan, manakala kepekatan yang lebih rendah (40, 30, 20, atau 10 μM) KAND 11 menghalang pertumbuhan akar dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 4a, b).Untuk menguji sama ada KAND 11 menjejaskan daya maju meristem akar, kami memeriksa meristem akar yang diwarnai dengan propidium iodide (PI) dan mengukur saiz kawasan meristem.Saiz meristem anak benih yang ditanam pada medium yang mengandungi 25 μM KAND-11 ialah 151.1 ± 32.5 μm, manakala saiz meristem anak benih yang ditanam pada medium kawalan yang mengandungi DMSO ialah 264.7 ± 30.8 μm (Rajah 4c, d). , yang menunjukkan bahawa KAND-11 memulihkan aktiviti selular.merebak.Meristem akar.Selaras dengan ini, rawatan KAND 11 mengurangkan jumlah penanda pembahagian sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS isyarat dalam meristem akar (Rajah 4e) 17 .Keputusan ini menunjukkan bahawa KAND 11 menghalang pertumbuhan akar dengan mengurangkan aktiviti percambahan sel.
Analisis kesan perencatan derivatif asid urbenonik (derivatif urbenyloxy) ke atas pertumbuhan.(a) Anak benih Col jenis liar berumur 7 hari yang ditanam pada plat MS dengan kepekatan KAND 11 yang ditunjukkan. Bar skala = 1 cm.(b) Kuantifikasi panjang akar.Huruf menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian Tukey HSD, ms< 0.05).n>16. Data ditunjukkan sebagai min ± SD.(c) Mikroskopi konfokal akar Col jenis liar yang diwarnai propidium iodida yang tumbuh pada plat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11. Tanda kurung putih menunjukkan meristem akar.Bar skala = 100 µm.(d) Kuantifikasi saiz meristem akar (n = 10 hingga 11).Perbezaan statistik ditentukan menggunakan ujian-t (ms< 0.05).Bar mewakili saiz meristem purata.(e) Mikroskopi kontras gangguan pembezaan (DIC) bagi meristem akar yang mengandungi binaan CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS diwarnakan dan diwarnakan pada anak benih berumur 5 hari yang ditanam pada plat MS dengan atau tanpa ujian KAND 25 µM.
Fitotoksisiti KAND 11 telah diuji selanjutnya menggunakan tumbuhan dikotiledon yang lain, tembakau (Nicotiana tabacum), dan organisma model tumbuhan darat utama, lumut hati (Marchantia polymorpha).Seperti dalam kes Arabidopsis, anak benih tembakau SR-1 yang ditanam pada medium yang mengandungi 25 μM KAND 11 menghasilkan akar yang lebih pendek (Rajah 5a).Selain itu, 40 daripada 48 biji benih bercambah pada plat yang mengandungi 200 μM KAND 11, manakala kesemua 48 biji benih bercambah pada media yang dirawat olok-olok, menunjukkan bahawa kepekatan KAND yang lebih tinggi adalah ketara (p< 0.05;chi test -square) menghalang percambahan tembakau.(Gamb. 5b).Di samping itu, kepekatan KAND 11 yang menghalang pertumbuhan bakteria dalam lumut hati adalah serupa dengan kepekatan berkesan dalam Arabidopsis (Rajah 5c).Keputusan ini menunjukkan bahawa KAND 11 boleh menghalang pertumbuhan pelbagai tumbuhan.Kami kemudiannya menyiasat kemungkinan sitotoksisiti sebatian berkaitan monoamida beruang dalam organisma lain, iaitu sel HeLa manusia dan strain Escherichia coli DH5α, sebagai wakil sel haiwan dan bakteria yang lebih tinggi, masing-masing.Dalam satu siri ujian percambahan sel, kami mendapati bahawa coumamonamide 1, asid coumamonamidic 6, dan KAND 11 tidak menjejaskan pertumbuhan sel HeLa atau E. coli pada kepekatan 100 μM (Rajah 5d, e).
Perencatan pertumbuhan KAND 11 dalam organisma bukan Arabidopsis.(a) Anak benih tembakau SR-1 jenis liar berumur dua minggu telah ditanam pada plat MS kedudukan menegak yang mengandungi 25 μM KAND 11. (b) Anak benih tembakau SR-1 jenis liar berumur dua minggu telah ditanam pada kedudukan mendatar Plat MS yang mengandungi 200 μM KAND 11. ( c) Pucuk lumut hati Tak-1 jenis liar berusia dua minggu yang ditanam pada plat Gamborg B5 dengan kepekatan KAND 11 yang ditunjukkan. Anak panah merah menunjukkan spora yang berhenti tumbuh dalam masa pengeraman dua minggu tempoh.(d) Ujian percambahan sel sel HeLa.Bilangan sel yang berdaya maju diukur pada selang masa tetap menggunakan kit pengiraan sel 8 (Dojindo).Sebagai kawalan, sel HeLa dirawat dengan 5 μg/ml actinomycin D (Act D), yang menghalang transkripsi polimerase RNA dan menyebabkan kematian sel.Analisis dilakukan dalam tiga kali ganda.(e) ujian proliferasi sel E. coli.Pertumbuhan E. coli dianalisis dengan mengukur OD600.Sebagai kawalan, sel telah dirawat dengan 50 μg/ml ampicillin (Amp), yang menghalang sintesis dinding sel bakteria.Analisis dilakukan dalam tiga kali ganda.
Untuk menguraikan mekanisme tindakan sitotoksisiti yang disebabkan oleh sebatian berkaitan uramide, kami menganalisis semula derivatif asid urbenik dengan kesan perencatan sederhana.seperti yang ditunjukkan pada gambar.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2b, 6a, anak benih yang ditanam pada plat agar yang mengandungi kepekatan tinggi (200 μM) asid urmotonik 6 menghasilkan akar yang lebih pendek dan melengkung kiri (θ = – 23.7 ± 6.1), manakala anak benih yang ditanam pada medium kawalan, anak pokok menghasilkan akar yang hampir lurus (θ = – 3.8 ± 7.1).Pertumbuhan serong ciri ini diketahui berpunca daripada disfungsi mikrotubul kortikal14,18.Selaras dengan penemuan ini, ubat-ubatan yang tidak stabil mikrotubule disopyramide dan oryzalin menyebabkan kecondongan akar yang serupa di bawah keadaan pertumbuhan kami (Rajah 2b, 6a).Pada masa yang sama, kami menguji derivatif asid urmotonik dan memilih beberapa daripadanya yang, pada kepekatan tertentu, mendorong pertumbuhan akar serong.Sebatian 8, 9, dan 15 menukar arah pertumbuhan akar pada 75 μM, 50 μM, dan 40 μM, masing-masing, menunjukkan bahawa sebatian ini boleh menjejaskan kestabilan mikrotubul dengan berkesan (Rajah 2b, 6a).Kami juga menguji derivatif asid ursolik yang paling mujarab, KAND 11, pada kepekatan yang lebih rendah (15 µM) dan mendapati penggunaan KAND 11 menghalang pertumbuhan akar dan arah pertumbuhan akar adalah tidak sekata, walaupun ia cenderung cerun ke kiri ( Rajah C3)..Oleh kerana kepekatan ubat-ubatan yang tidak stabil mikrotubulus yang lebih tinggi kadangkala menghalang pertumbuhan tumbuhan dan bukannya menyebabkan kecondongan akar, kami kemudiannya menilai kemungkinan bahawa KAND 11 menjejaskan mikrotubul dengan memerhati mikrotubul kortikal dalam sel epidermis akar.Imunohistokimia menggunakan antibodi anti-β-tubulin dalam sel epidermis akar anak benih yang dirawat dengan 25 μM KAND 11 menunjukkan kehilangan hampir semua mikrotubul kortikal dalam sel epidermis dalam zon pemanjangan (Rajah 6b).Keputusan ini menunjukkan bahawa asid kumamotonik dan derivatifnya bertindak secara langsung atau tidak langsung pada mikrotubul untuk mengganggu mereka dan bahawa sebatian ini adalah perencat mikrotubulu baru.
Asid Ursonik dan derivatifnya mengubah mikrotubul kortikal dalam Arabidopsis thaliana.(a) Sudut kecondongan akar diukur dengan kehadiran pelbagai derivatif asid urmotonik pada kepekatan yang ditunjukkan.Kesan dua sebatian yang diketahui menghalang mikrotubul: disopyramide dan oryzalin juga dianalisis.Inset menunjukkan piawai yang digunakan untuk mengukur sudut pertumbuhan akar.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan perlakuan palsu (ujian t, ms< 0.05).n>19. Bar skala = 1 cm.(b) Mikrotubul kortikal dalam sel epidermis dalam zon pemanjangan.Mikrotubul dalam akar Arabidopsis Col jenis liar yang ditanam pada plat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11 divisualisasikan dengan pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi primer β-tubulin dan antibodi sekunder konjugasi Alexa Fluor.Bar skala = 10 µm.(c) Struktur mitosis mikrotubul dalam meristem akar.Microtubules telah divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia.Struktur mitosis, termasuk zon prophase, gelendong, dan phragmoplast, dikira daripada imej confocal.Anak panah menunjukkan struktur mikrotubulus mitosis.Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan perlakuan palsu (ujian t, ms< 0.05).n>9. Bar skala = 50 µm.
Walaupun Ursa mempunyai keupayaan untuk mengganggu fungsi mikrotubulus, mekanisme tindakannya dijangka berbeza daripada agen penyahpolimeran mikrotubulus biasa.Sebagai contoh, kepekatan agen penyahpolimeran mikrotubule yang lebih tinggi seperti disopyramide dan oryzalin mendorong pengembangan anisotropik sel epidermis, manakala KAND 11 tidak.Di samping itu, aplikasi bersama KAND 11 dan disopyramide menghasilkan tindak balas pertumbuhan akar yang disebabkan disopyramide dan perencatan pertumbuhan yang disebabkan oleh KAND 11 telah diperhatikan (Rajah S4).Kami juga menganalisis tindak balas mutan disopyramide 1-1 (phs1-1) hipersensitif kepada KAND 11. phs1-1 mempunyai mutasi titik tubulin kinase bukan kanonik dan menghasilkan akar yang lebih pendek apabila dirawat dengan disopyramide9,20.Anak benih mutan phs1-1 yang ditanam pada medium agar yang mengandungi KAND 11 mempunyai akar yang lebih pendek sama seperti yang ditanam pada disopyramid (rajah S5).
Di samping itu, kami memerhatikan struktur mikrotubulus mitosis, seperti zon prophase, gelendong, dan phragmoplast, dalam meristem akar anak benih yang dirawat dengan KAND 11. Selaras dengan pemerhatian untuk CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan ketara dalam bilangan mikrotubulus mitosis diperhatikan (Rajah .6c).
Untuk mencirikan sitotoksisiti KAND 11 pada resolusi subselular, kami merawat sel penggantungan BY-2 tembakau dengan KAND 11 dan memerhatikan tindak balasnya.Kami mula-mula menambah KAND 11 kepada sel BY-2 yang menyatakan TagRFP-TUA6, yang melabelkan mikrotubul secara pendarfluor, untuk menilai kesan KAND 11 pada mikrotubul kortikal.Ketumpatan mikrotubulus kortikal dinilai menggunakan analisis imej, yang mengukur peratusan piksel sitoskeletal di kalangan piksel sitoplasma.Keputusan ujian menunjukkan bahawa selepas rawatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam, ketumpatan menurun dengan ketara kepada 0.94 ± 0.74% atau 0.23 ± 0.28%, masing-masing, manakala ketumpatan sel yang dirawat dengan DMSO, berjumlah 1.61 ± 0.34. % (Rajah 7a).Keputusan ini konsisten dengan pemerhatian dalam Arabidopsis bahawa rawatan KAND 11 mendorong penyahpolimeran mikrotubul kortikal (Rajah 6b).Kami juga memeriksa garisan BY-2 dengan filamen aktin berlabel GFP-ABD selepas rawatan dengan kepekatan KAND 11 yang sama dan mendapati bahawa rawatan KAND 11 mengganggu filamen aktin.Rawatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam dengan ketara mengurangkan ketumpatan filamen aktin kepada 1.20 ± 0.62% atau 0.61 ± 0.26%, masing-masing, manakala ketumpatan dalam sel yang dirawat DMSO ialah 1.69 ± 0.51% (Rajah 2).7b).Keputusan ini berbeza dengan kesan propyzamide, yang tidak menjejaskan filamen aktin, dan latrunculin B, penyahpolimerisasi aktin yang tidak menjejaskan mikrotubul (SI Rajah S6).Di samping itu, rawatan dengan coumamonamide 1, asid coumamonamide 6, atau KAND 11 tidak menjejaskan mikrotubul dalam sel HeLa (SI Rajah S7).Oleh itu, mekanisme tindakan KAND 11 dipercayai berbeza daripada pengganggu sitoskeleton yang diketahui.Di samping itu, pemerhatian mikroskopik kami terhadap sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 mendedahkan permulaan kematian sel semasa rawatan KAND 11 dan menunjukkan bahawa bahagian sel mati berwarna biru Evans tidak meningkat dengan ketara selepas 30 minit rawatan KAND 11, sedangkan selepas 90 minit rawatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND, bilangan sel mati masing-masing meningkat kepada 43.7% atau 80.1% (Rajah 7c).Diambil bersama, data ini menunjukkan bahawa terbitan asid ursolik novel KAND 11 ialah perencat sitoskeletal khusus tumbuhan dengan mekanisme tindakan yang tidak diketahui sebelumnya.
KAND menjejaskan mikrotubul kortikal, filamen aktin dan daya maju sel BY-2 tembakau.(a) Visualisasi mikrotubul kortikal dalam sel BY-2 dengan kehadiran TagRFP-TUA6.Sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa oleh mikroskop confocal.Ketumpatan mikrotubulus kortikal dikira daripada mikrograf 25 sel bebas.Huruf menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian Tukey HSD, ms< 0.05).Bar skala = 10 µm.( b ) Filamen aktin kortikal dalam sel BY-2 yang divisualisasikan dengan kehadiran GFP-ABD2.Sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO diperiksa oleh mikroskop confocal.Ketumpatan filamen aktin kortikal dikira daripada mikrograf 25 sel bebas.Huruf menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian Tukey HSD, ms< 0.05).Bar skala = 10 µm.(c) Pemerhatian sel BY-2 mati oleh pewarnaan biru Evans.Sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO telah diperiksa oleh mikroskop medan terang.n=3.Bar skala = 100 µm.
Penemuan dan aplikasi produk semula jadi baru telah membawa kepada kemajuan yang ketara dalam pelbagai aspek kehidupan manusia, termasuk perubatan dan pertanian.Penyelidikan sejarah telah dijalankan untuk mendapatkan sebatian berguna daripada sumber semula jadi.Khususnya, actinomycetes diketahui berguna sebagai antibiotik antiparasit untuk nematod kerana keupayaannya untuk menghasilkan pelbagai metabolit sekunder seperti avermectin, sebatian plumbum ivermectin dan bleomycin dan derivatifnya, digunakan secara perubatan sebagai agen antikanser21,22.Begitu juga, pelbagai sebatian herbisida telah ditemui daripada actinomycetes, sebahagian daripadanya telah digunakan secara komersial1,23.Oleh itu, analisis metabolit actinomycete untuk mengasingkan produk semulajadi dengan aktiviti biologi yang dikehendaki dianggap sebagai strategi yang berkesan.Dalam kajian ini, kami menemui sebatian baharu, kuumamonamide, daripada S. werraensis dan berjaya mensintesiskannya.Asid ursonik ialah perantaraan sintetik urbenamide dan derivatifnya.Ia boleh menyebabkan ciri keriting akar, mempamerkan aktiviti herbisida yang sederhana hingga kuat, dan secara langsung atau tidak langsung merosakkan mikrotubul tumbuhan.Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan asid urmotonik mungkin berbeza daripada perencat mikrotubule sedia ada, kerana KAND 11 juga mengganggu filamen aktin dan menyebabkan kematian sel, mencadangkan mekanisme pengawalseliaan yang mana asid urmotonik dan derivatifnya mempengaruhi pelbagai struktur sitoskeletal..
Pencirian terperinci asid urbenonik akan membantu untuk lebih memahami mekanisme tindakan asid urbenonik.Khususnya, matlamat seterusnya adalah untuk menilai keupayaan asid ursonik untuk mengikat kepada mikrotubul yang dikurangkan untuk menentukan sama ada asid ursonik dan derivatifnya bertindak secara langsung pada mikrotubul dan menyahpolimerkannya, atau sama ada tindakannya mengakibatkan ketidakstabilan mikrotubulu.Di samping itu, dalam kes di mana mikrotubul bukan sasaran langsung, mengenal pasti tapak tindakan dan sasaran molekul asid ursonik pada sel tumbuhan akan membantu memahami lebih lanjut sifat sebatian yang berkaitan dan kemungkinan cara untuk meningkatkan aktiviti racun herba.Ujian bioaktiviti kami mendedahkan keupayaan sitotoksik unik asid ursonik pada pertumbuhan tumbuhan seperti Arabidopsis thaliana, tembakau dan lumut hati, manakala sel E. coli mahupun HeLa tidak terjejas.Ketoksikan yang sedikit atau tiada kepada sel haiwan adalah kelebihan derivatif asid ursonik jika ia dibangunkan sebagai racun herba untuk digunakan dalam bidang pertanian terbuka.Sesungguhnya, kerana mikrotubul adalah struktur biasa dalam eukariota, perencatan selektif mereka dalam tumbuhan adalah keperluan utama untuk racun herba.Contohnya, propyzamide, agen penyahpolimeran mikrotubulus yang mengikat secara langsung kepada tubulin dan menghalang pempolimeran, digunakan sebagai racun herba kerana ketoksikannya yang rendah kepada sel haiwan24.Berbeza dengan disopyramide, benzamida yang berkaitan mempunyai kekhususan sasaran yang berbeza.Sebagai tambahan kepada mikrotubul tumbuhan, RH-4032 atau benzoxamide juga menghalang mikrotubul sel haiwan atau oomycetes, masing-masing, dan zalilamide digunakan sebagai racun kulat kerana fitotoksisitinya yang rendah25,26,27.Beruang yang baru ditemui dan derivatifnya mempamerkan sitotoksisiti terpilih terhadap tumbuhan, tetapi perlu diperhatikan bahawa pengubahsuaian selanjutnya boleh mengubah kekhususan sasarannya, yang berpotensi menyediakan derivatif tambahan untuk mengawal kulat patogen atau oomycetes.
Sifat unik asid urbenonik dan derivatifnya berguna untuk pembangunannya sebagai racun herba dan digunakan sebagai alat penyelidikan.Kepentingan sitoskeleton dalam mengawal bentuk sel tumbuhan diiktiraf secara meluas.Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa tumbuhan telah mengembangkan mekanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal dengan mengawal dinamik mikrotubulus untuk mengawal morfogenesis dengan betul.Sebilangan besar molekul yang bertanggungjawab untuk pengawalan aktiviti mikrotubulus telah dikenalpasti, dan penyelidikan berkaitan masih berterusan3,4,28.Pemahaman semasa kami tentang dinamik microtubule dalam sel tumbuhan tidak menerangkan sepenuhnya mekanisme organisasi mikrotubule kortikal.Sebagai contoh, walaupun kedua-dua disopyramide dan oryzalin boleh menyahpolimer mikrotubul, disopyramide menyebabkan herotan akar yang teruk manakala oryzalin mempunyai kesan yang agak ringan.Selain itu, mutasi dalam tubulin, yang menstabilkan mikrotubulus, juga menyebabkan dextrorotation dalam akar, manakala paclitaxel, yang juga menstabilkan dinamik mikrotubule, tidak.Oleh itu, mengkaji dan mengenal pasti sasaran molekul asid ursolik harus memberikan pandangan baharu tentang peraturan mikrotubul kortikal tumbuhan.Begitu juga, perbandingan masa depan bahan kimia yang berkesan dalam menggalakkan pertumbuhan herot, seperti disopyramide, dan bahan kimia yang kurang berkesan, seperti oryzalin atau asid kumamotorik, akan memberikan petunjuk tentang bagaimana pertumbuhan herot berlaku.
Sebaliknya, penyusunan semula sitoskeletal berkaitan pertahanan adalah satu lagi kemungkinan untuk menjelaskan sitotoksisiti asid ursonik.Jangkitan patogen atau pengenalan elicitor ke dalam sel tumbuhan kadangkala menyebabkan kemusnahan sitoskeleton dan kematian sel seterusnya29.Sebagai contoh, cryptoxanthin yang berasal dari oomycete telah dilaporkan mengganggu mikrotubul dan filamen aktin sebelum kematian sel tembakau, sama seperti yang berlaku dengan rawatan KAND30,31.Persamaan antara tindak balas pertahanan dan tindak balas selular yang disebabkan oleh asid ursonik menyebabkan kami membuat hipotesis bahawa ia mencetuskan proses selular biasa, walaupun kesan asid ursonik yang lebih cepat dan lebih kuat daripada cryptoxanthin adalah jelas.Walau bagaimanapun, kajian telah menunjukkan bahawa gangguan filamen aktin menggalakkan kematian sel spontan, yang tidak selalu disertai dengan gangguan mikrotubulus29.Di samping itu, masih perlu dilihat sama ada sama ada patogen atau elisitor menyebabkan pertumbuhan akar yang herot, seperti yang dilakukan oleh derivatif asid ursonik.Oleh itu, pengetahuan molekul yang menghubungkan tindak balas pertahanan dan sitoskeleton adalah masalah yang menarik untuk ditangani.Dengan mengeksploitasi kehadiran sebatian berat molekul rendah yang berkaitan dengan asid ursonik, serta pelbagai derivatif dengan potensi yang berbeza-beza, mereka mungkin memberi peluang untuk menyasarkan mekanisme selular yang tidak diketahui.
Secara keseluruhannya, penemuan dan penggunaan sebatian baharu yang memodulasi dinamik mikrotubul akan menyediakan kaedah yang berkuasa untuk menangani mekanisme molekul kompleks yang mendasari penentuan bentuk sel tumbuhan.Dalam konteks ini, asid urmotonik sebatian yang baru dibangunkan, yang menjejaskan mikrotubul dan filamen aktin dan mendorong kematian sel, mungkin memberi peluang untuk menguraikan hubungan antara kawalan mikrotubulus dan mekanisme lain ini.Oleh itu, analisis kimia dan biologi menggunakan asid urbenonik akan membantu kita memahami mekanisme pengawalseliaan molekul yang mengawal sitoskeleton tumbuhan.
Inokulasi S. werraensis MK493-CF1 ke dalam kelalang Erlenmeyer 500 mL terkeliru yang mengandungi 110 mL medium benih yang terdiri daripada 2% (b/v) galaktosa, 2% (b/v) pes Esen, 1% ( b/v) komposisi Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepun), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 dan 0.2% CaCO3 dalam air ternyahion.(pH 7.4 sebelum pensterilan).Kultur benih diinkubasi pada penggoncang berputar (180 rpm) pada suhu 27°C selama 2 hari.Penanaman pengeluaran melalui penapaian keadaan pepejal.Kultur benih (7 ml) dipindahkan ke dalam kelalang K-1 500 ml yang mengandungi 40 g medium pengeluaran yang terdiri daripada 15 g barli yang ditekan (MUSO Co., Ltd., Jepun) dan 25 g air ternyahion (pH tidak dilaraskan). sebelum pensterilan).).Penapaian dilakukan pada suhu 30°C dalam gelap selama 14 hari.Bahan penapaian telah diekstrak dengan 40 ml/botol EtOH dan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 min).Supernatan kultur (60 ml) telah diekstrak dengan campuran 10% MeOH/EtOAc.Lapisan organik telah disejat di bawah tekanan yang dikurangkan untuk mendapatkan sisa (59.5 mg), yang tertakluk kepada HPLC dengan elusi kecerunan (0-10 minit: 90%) pada lajur fasa terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minit: 90% H2O/CH3CN hingga 70% H2O/CH3CN (kecerunan), 35–45 minit: 90% H2O/EtOH, 45–155 minit: 90% H2O /EtOH kepada 100% EtOH (kecerunan (kecerunan), 155–200 min: 100% EtOH) pada kadar alir 1.5 ml/min, kuumamonamida (1, 36.0 mg) diasingkan sebagai serbuk amorf putih.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai terkira: 141.0659, nilai terukur: 141.0663, IR νmaks 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1538 cm
Benih Columbia (Col-0) diperoleh daripada Pusat Sumber Biologi Arabidopsis (ABRC) dengan kebenaran untuk kegunaan penyelidikan.Biji benih Col-0 telah dibiakkan dan dikekalkan di bawah keadaan makmal kami dan digunakan sebagai tumbuhan Arabidopsis jenis liar.Biji Arabidopsis disterilkan di permukaan dan dikultur dalam medium Murashige dan Skoog separuh kekuatan yang mengandungi 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical ).) dan 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, pada 23 °C dan cahaya malar.Benih mutan phs1-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara).
Benih terikan SR-1 telah disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara) dan digunakan sebagai tumbuhan tembakau jenis liar.Biji tembakau disterilkan di permukaan dan direndam dalam air steril selama tiga malam untuk menggalakkan percambahan, kemudian diletakkan dalam larutan separuh kekuatan yang mengandungi 2% sukrosa, 0.05% (w/v) MES dan 0.8% getah gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.dan medium Skoog) dengan pH 5.7 dan diinkubasi pada 23°C di bawah cahaya malar.
Strain Tak-1 telah disediakan oleh T. Kohchi (Universiti Kyoto) dan digunakan sebagai unit eksperimen standard untuk kajian lumut hati.Gemma diperoleh daripada tumbuhan kultur yang disterilkan dan kemudian disalut pada medium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yang mengandungi 1% sukrosa dan 0.3% gam gellan dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya berterusan.
Sel BY-2 tembakau (Nicotiana tabacum L. cv. Kuning Terang 2) disediakan oleh S. Hasezawa (Universiti Tokyo).Sel BY-2 telah dicairkan 95 kali ganda dalam medium Linsmeier dan Skoog yang diubah suai dan ditambah setiap minggu dengan asid 2,4-diklorofenoksiasetik 32 .Suspensi sel dicampur pada penggoncang berputar pada 130 rpm pada 27°C dalam keadaan gelap.Basuh sel dengan 10 kali ganda isipadu medium segar dan resuspensi dalam medium yang sama.Talian sel transgenik BY-2 secara stabil menyatakan penanda mikrotubule TagRFP-TUA6 atau penanda filamen aktin GFP-ABD2 di bawah promoter virus mozek kembang kol 35S telah dihasilkan seperti yang diterangkan33,34,35.Talian sel ini boleh dikekalkan dan disegerakkan menggunakan prosedur yang serupa dengan yang digunakan untuk talian sel BY-2 asal.
Sel HeLa telah dikultur dalam medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) ditambah dengan 10% serum lembu janin, 1.2 U/ml penisilin, dan 1.2 μg/ml streptomycin dalam inkubator 37°C dengan 5% CO2.
Semua eksperimen yang diterangkan dalam manuskrip ini telah dilakukan mengikut peraturan dan garis panduan biokeselamatan Jepun.
Sebatian telah dibubarkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sebagai larutan stok dan dicairkan dalam medium MS untuk Arabidopsis dan tembakau atau medium Gamborg B5 untuk lumut hati.Untuk ujian perencatan pertumbuhan akar, lebih daripada 10 biji setiap pinggan telah disemai pada medium agar yang mengandungi sebatian yang ditunjukkan atau DMSO.Benih diinkubasi di dalam ruang pertumbuhan selama 7 hari.Anak benih diambil gambar dan panjang akarnya diukur.Untuk ujian percambahan Arabidopsis, 48 biji setiap pinggan disemai pada medium agar yang mengandungi 200 μM sebatian atau DMSO.Benih Arabidopsis ditanam di dalam ruang pertumbuhan dan bilangan anak benih yang bercambah dikira 7 hari selepas percambahan (dag).Untuk ujian percambahan tembakau, 24 biji setiap pinggan disemai pada medium agar yang mengandungi 200 μM KAND atau DMSO.Benih tembakau ditanam di dalam ruang tumbesaran dan bilangan anak benih yang bercambah dikira selepas 14 hari.Untuk ujian perencatan pertumbuhan lumut hati, 9 embrio daripada setiap plat disalut pada medium agar yang mengandungi kepekatan KAND atau DMSO yang ditunjukkan dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 14 hari.
Gunakan anak benih yang diwarnai dengan 5 mg/ml propidium iodide (PI) untuk menggambarkan organisasi meristem akar.Isyarat PI diperhatikan oleh mikroskop pendarfluor menggunakan mikroskop pengimbasan laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar dengan β-glucuronidase (GUS) dilakukan mengikut protokol yang diterangkan oleh Malami dan Benfey36.Anak benih difiksasi dalam 90% aseton semalaman, diwarnakan dengan 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid dalam penampan GUS selama 1 jam dan diletakkan dalam larutan kloraldehid terhidrat.(8 g kloral hidrat, 2 ml air dan 1 ml gliserol) dan diperhatikan dengan mikroskop kontras gangguan pembezaan menggunakan mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur pada anak benih berumur 7 hari yang ditanam di atas pinggan yang diletakkan menegak.Ukur sudut punca dari arah vektor graviti seperti yang diterangkan dalam langkah 6.
Susunan mikrotubul kortikal diperhatikan seperti yang diterangkan, dengan pengubahsuaian kecil pada protokol 37 .Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dan Alexa Fluor 488-conjugated anti-tikus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder pada pencairan 1:1000 dan 1:100, masing-masing.Imej pendarfluor diperoleh menggunakan mikroskop pengimbasan laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Dapatkan imej timbunan Z dan cipta unjuran keamatan maksimum mengikut arahan pengilang.
Ujian percambahan sel HeLa dilakukan menggunakan Kit Pengiraan Sel 8 (Dojindo) mengikut arahan pengilang.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis dengan mengukur ketumpatan sel dalam kultur menggunakan spektrofotometer pada 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dalam sel BY-2 transgenik diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor yang dilengkapi dengan peranti pengimbasan confocal CSU-X1 (Yokogawa) dan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).Ketumpatan sitoskeletal dinilai dengan analisis imej, yang mengukur peratusan piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma dalam imej confocal menggunakan perisian ImageJ seperti yang diterangkan38, 39.
Untuk mengesan kematian sel dalam sel BY-2, satu aliquot penggantungan sel diinkubasi dengan 0.05% Evans blue selama 10 minit pada suhu bilik.Pewarnaan biru Evans sel-sel mati yang terpilih bergantung kepada penyemperitan pewarna daripada sel yang berdaya maju oleh membran plasma yang utuh40.Sel-sel bernoda diperhatikan menggunakan mikroskop medan terang (BX53, Olympus).
Sel HeLa telah ditanam dalam DMEM ditambah dengan 10% FBS dalam inkubator lembap pada 37°C dan 5% CO2.Sel telah dirawat dengan 100 μM KAND 11, asid kumamonamik 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), atau 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) selama 6 jam pada 37 ° C.Sel telah ditetapkan dengan MetOH selama 10 minit dan kemudian dengan asetat selama 5 minit pada suhu bilik.Sel tetap diinkubasi dengan antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) yang dicairkan dalam 0.5% BSA/PBS selama 2 jam, dibasuh 3 kali dengan TBST, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi kambing Alexa Fluor.488 1 jam.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) dan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dicairkan dalam 0.5% BSA/PBS.Selepas mencuci dengan TBST tiga kali, sel-sel bernoda diperhatikan pada mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E.Imej telah ditangkap dengan kamera Hamamatsu ORCA-R2 CCD yang disejukkan menggunakan perisian MetaMorph (Peranti Molekul).
Masa siaran: Jun-17-2024