Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk hasil terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan versi pelayar anda yang lebih baharu (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, bagi memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan laman web ini tanpa penggayaan atau JavaScript.
Penemuan dan penggunaan produk semula jadi yang bermanfaat dapat membantu meningkatkan kehidupan manusia. Bahan kimia perencat pertumbuhan tumbuhan digunakan secara meluas sebagai racun herba untuk mengawal rumpai. Disebabkan keperluan untuk menggunakan pelbagai jenis racun herba, terdapat keperluan untuk mengenal pasti sebatian dengan mekanisme tindakan baharu. Dalam kajian ini, kami menemui sebatian N-alkoksipirola baharu, kumamonamida, daripada Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan mewujudkan proses sintesis yang lengkap. Melalui ujian aktiviti biologi, kami mendapati bahawa asid urs-monoamik ialah perantaraan sintetik urs-monoamida dan berpotensiperencat pertumbuhan tumbuhanDi samping itu, kami telah membangunkan pelbagai derivatif asid urbenonik, termasuk derivatif urbenyloksi (UDA), yang mempunyai aktiviti herbisida yang tinggi tanpa menjejaskan pertumbuhan sel HeLa secara negatif. Kami juga mendapati bahawa derivatif asid urmotonik mengganggu mikrotubul tumbuhan; di samping itu, KAND mempengaruhi filamen aktin dan mendorong kematian sel; Kesan pelbagai rupa ini berbeza daripada kesan perencat mikrotubul yang diketahui dan mencadangkan mekanisme tindakan baharu untuk asid ursonik, yang mewakili kelebihan penting dalam pembangunan racun herba baharu.
Penemuan dan aplikasi praktikal produk semula jadi yang bermanfaat dan terbitannya merupakan cara untuk meningkatkan kualiti hidup manusia. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisma, tumbuhan dan serangga telah membawa kepada kemajuan besar dalam perubatan dan pertanian. Banyak antibiotik dan ubat anti-leukemia telah dibangunkan daripada produk semula jadi. Di samping itu, pelbagai jenisracun perosak, racun kulat dan racun herba diekstrak daripada produk semula jadi ini untuk digunakan dalam pertanian. Khususnya, racun herba kawalan rumpai merupakan alat penting untuk meningkatkan hasil tanaman dalam pertanian moden, dan pelbagai jenis sebatian telah digunakan secara komersial. Beberapa proses selular dalam tumbuhan, seperti fotosintesis, metabolisme asid amino, sintesis dinding sel, pengawalaturan mitosis, isyarat fitohormon, atau sintesis protein, dianggap sebagai sasaran tipikal racun herba. Sebatian yang menghalang fungsi mikrotubul adalah kelas racun herba biasa yang mempengaruhi pertumbuhan tumbuhan dengan mempengaruhi pengawalaturan mitosis2.
Mikrotubul merupakan komponen sitoskeleton dan dipelihara secara meluas dalam sel eukariotik. Heterodimer tubulin terdiri daripada α-tubulin dan β-tubulin yang membentuk protofilamen mikrotubul linear, dengan 13 protofilamen membentuk struktur silinder. Mikrotubul memainkan pelbagai peranan dalam sel tumbuhan, termasuk menentukan bentuk sel, pembahagian sel dan pengangkutan intraselular3,4. Sel tumbuhan mengandungi mikrotubul di bawah membran plasma antara fasa, dan mikrotubul kortikal ini dipercayai mengawal organisasi mikrofibril selulosa melalui pengawalaturan kompleks sintase selulosa4,5. Mikrotubul kortikal sel epidermis akar, yang terdapat di zon pemanjangan pesat hujung akar, terletak di sisi, dan gentian mikroselulosa mengikuti mikrotubul ini dan mengehadkan arah pengembangan sel, sekali gus menggalakkan pemanjangan sel anisotropik. Oleh itu, fungsi mikrotubul berkait rapat dengan morfologi tumbuhan. Penggantian asid amino dalam gen yang mengekod tubulin menyebabkan kecondongan susunan mikrotubul kortikal dan pertumbuhan sebelah kiri atau kanan dalam Arabidopsis 6,7. Begitu juga, mutasi dalam protein berkaitan mikrotubul yang mengawal selia dinamik mikrotubul juga boleh menyebabkan pertumbuhan akar yang terdistorsi8,9,10,11,12,13. Di samping itu, rawatan dengan racun herba yang mengganggu mikrotubul seperti disopiramid, juga dikenali sebagai pretilachlor, juga menyebabkan pertumbuhan akar serong sebelah kiri14. Data ini menunjukkan bahawa pengawalaturan fungsi mikrotubul yang tepat adalah penting untuk menentukan arah pertumbuhan tumbuhan.
Pelbagai jenis perencat mikrotubul telah ditemui, dan ubat-ubatan ini telah memberikan sumbangan yang ketara kepada penyelidikan sitoskeletal, serta kepada pertanian dan perubatan2. Khususnya, oryzalin, sebatian dinitroanilin, disopiramid, sebatian berkaitan benzamida, dan analognya boleh menghalang fungsi mikrotubul dan dengan itu menghalang pertumbuhan tumbuhan. Oleh itu, ia digunakan secara meluas sebagai racun herba. Walau bagaimanapun, memandangkan mikrotubul merupakan komponen penting dalam sel tumbuhan dan haiwan, kebanyakan perencat mikrotubul adalah sitotoksik kepada kedua-dua jenis sel. Oleh itu, walaupun kegunaannya yang diiktiraf sebagai racun herba, sebilangan kecil agen antimikrotubul digunakan untuk tujuan praktikal.
Streptomyces ialah genus daripada keluarga Streptomyces, yang merangkumi bakteria aerobik, gram-positif, berfilamen dan dikenali ramai kerana keupayaannya menghasilkan pelbagai metabolit sekunder. Oleh itu, ia dianggap sebagai salah satu sumber produk semula jadi baharu yang aktif secara biologi yang paling penting. Dalam kajian semasa, kami menemui sebatian baharu yang dipanggil coumamonamide, yang diasingkan daripada Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan S. werraensis ISP 5486. Menggunakan analisis spektrum dan analisis spektrum penuh, struktur coumamonamide dicirikan dan rangka N-alkoxypyrrole uniknya ditentukan. sintesis. Asid Ursmonik, perantaraan sintetik ursmonoamide dan derivatifnya, didapati menghalang pertumbuhan dan percambahan tumbuhan model popular Arabidopsis thaliana. Dalam kajian hubungan struktur-aktiviti, kami mendapati bahawa sebatian dengan C9 yang diubah suai kepada asid ursonik, yang dipanggil terbitan noniloksi asid ursonik (KAND), meningkatkan kesan perencatan terhadap pertumbuhan dan percambahan dengan ketara. Terutamanya, perencat pertumbuhan tumbuhan yang baru ditemui juga mempengaruhi pertumbuhan tembakau dan lumut hati dan tidak sitotoksik kepada bakteria atau sel HeLa. Selain itu, beberapa derivatif asid urmotonik mendorong fenotip akar yang terdistorsi, yang menunjukkan bahawa derivatif ini secara langsung atau tidak langsung mempengaruhi mikrotubul. Selaras dengan idea ini, pemerhatian kami terhadap mikrotubul yang dilabel sama ada secara imunohistokimia atau dengan protein pendarfluor menunjukkan bahawa rawatan KAND menyahpolimerisasi mikrotubul. Di samping itu, rawatan dengan derivatif asid kumamotonik mengganggu mikrofilamen aktin. Oleh itu, kami telah menemui perencat pertumbuhan tumbuhan baharu yang mekanisme tindakan uniknya melibatkan pemusnahan sitoskeleton.
Strain MK493-CF1 telah diasingkan daripada tanah di Shinagawa-ku, Tokyo. Strain MK493-CF1 membentuk miselium stroma bercabang baik. Urutan separa gen RNA ribosom 16S (1422 bp) telah ditentukan. Strain ini sangat serupa dengan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipikal, 99.93%). Berdasarkan keputusan ini, telah ditentukan bahawa strain ini berkait rapat dengan strain jenis S. werraensis. Oleh itu, kami menamakan strain ini sebagai S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T juga menghasilkan sebatian bioaktif yang sama. Memandangkan terdapat sedikit kajian awal untuk mendapatkan produk semula jadi daripada mikroorganisma ini, kajian kimia selanjutnya telah dijalankan. Selepas penanaman S. werraensis MK493-CF1 pada medium barli melalui penapaian keadaan pepejal pada suhu 30°C selama 14 hari, medium tersebut diekstrak dengan 50% EtOH. 60 ml sampel dikeringkan untuk mendapatkan 59.5 mg ekstrak mentah. Ekstrak mentah tersebut menjalani HPLC fasa terbalik untuk menghasilkan N-metoksi-1H-pirola-2-karboksamida (1, dinamakan kuumamonamida, 36.0 mg). Jumlah keseluruhan 1 adalah lebih kurang 60% daripada ekstrak mentah. Oleh itu, kami memutuskan untuk mengkaji secara terperinci sifat-sifat kumamotoamida 1.
Kumamonamida 1 ialah serbuk amorfus putih dan spektrometri jisim resolusi tinggi (HRESIMS) mengesahkan C6H8N2O2 (Rajah 1). Serpihan pirol tersubstitusi C2 bagi sebatian ini dicirikan oleh δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH dalam spektrum 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) dan δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), dan spektrum 13C NMR menunjukkan kehadiran empat atom karbon sp2. Kehadiran kumpulan amida pada kedudukan C2 dinilai melalui korelasi HMBC daripada proton C-3 kepada karbon karbonil amida pada δC 161.1. Di samping itu, puncak 1 H dan 13 C NMR pada δH 4.10 (3H, S) dan δC 68.3 menunjukkan kehadiran kumpulan N-metoksi dalam molekul. Walaupun kedudukan kumpulan metoksi yang betul masih belum ditentukan menggunakan analisis spektroskopi seperti spektroskopi perbezaan dipertingkatkan dan singkatan Overhauser nuklear (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida menjadi sebatian calon pertama.
Untuk menentukan struktur 1 yang betul, sintesis total telah dilakukan (Rajah 2a). Rawatan 2-aminopyridina 2 yang tersedia secara komersial dengan m-CPBA menghasilkan N-oksida 3 yang sepadan dalam hasil kuantitatif. Selepas 2-aminoazidasi 2, tindak balas siklokondensasi yang diterangkan oleh Abramovich telah dijalankan dalam benzena pada suhu 90°C untuk mendapatkan 1-hidroksi-1H-pirola-2-karbonitril 5 yang dikehendaki dalam gram. Kelajuan 60% (dua peringkat). 15,16. Metilasi dan hidrolisis 4 kemudiannya menghasilkan 1-metoksi-1H-pirola-2-asid karboksilik (dipanggil "asid kumotonik", 6) dalam hasil yang baik (70%, dua langkah). Akhir sekali, amidasi melalui perantaraan asid klorida 6 menggunakan ammonia akueus memberikan Kumamoto amida 1 dalam hasil 98%. Semua data spektrum 1 yang disintesis adalah serupa dengan 1 terpencil, jadi struktur 1 telah ditentukan;
Sintesis umum dan analisis aktiviti biologi urbenamide dan asid urbenik. (a) Sintesis total amida Kumamoto. (b) Anak benih Arabidopsis Columbia (Col) jenis liar berusia tujuh hari ditanam pada plat Murashige dan Skoog (MS) yang mengandungi kumamonamide 6 atau kumamonamide 1 pada kepekatan yang ditunjukkan. Bar skala = 1 cm.
Pertama, kami menilai aktiviti biologi urbenamide dan perantaraannya untuk keupayaannya memodulasi pertumbuhan tumbuhan. Kami menambah pelbagai kepekatan ursmonamide 1 atau asid ursmonik 6 kepada medium agar MS dan anak benih Arabidopsis thaliana yang dikultur pada medium ini. Ujian ini menunjukkan bahawa kepekatan tinggi (500 μM) 6 menghalang pertumbuhan akar (Rajah 2b). Seterusnya, kami menghasilkan pelbagai derivatif dengan menggantikan kedudukan N1 6 dan menjalankan kajian hubungan struktur-aktiviti ke atasnya (proses sintesis analog diterangkan dalam Maklumat Sokongan (SI)). Anak benih Arabidopsis ditanam pada medium yang mengandungi 50 μM derivatif asid ursonik, dan panjang akar diukur seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3a, b, dan S1, asid kumamo mempunyai panjang rantai alkoksi linear (9, 10, 11, 12, dan 13) atau rantai alkoksi besar (15, 16, dan 17) yang berbeza pada kedudukan N1. Derivatif menunjukkan perencatan pertumbuhan akar yang ketara. Di samping itu, kami mendapati bahawa penggunaan 200 μM 10, 11, atau 17 menghalang percambahan (Rajah 3c dan S2).
Kajian hubungan struktur-aktiviti amida Kumamoto dan sebatian berkaitan. (a) Skema struktur dan sintesis analog. (b) Kuantifikasi panjang akar anak benih berusia 7 hari yang ditanam pada medium MS dengan atau tanpa derivatif kumamonamide 50 μM. Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan rawatan palsu (ujian t, p< 0.05). n>18. Data ditunjukkan sebagai min ± SD. nt bermaksud “tidak diuji” kerana lebih daripada 50% biji benih tidak bercambah. (c) Kuantifikasi kadar percambahan biji benih yang dirawat yang diinkubasi selama 7 hari dalam medium MS dengan atau tanpa 200 μM kumamonamide dan sebatian berkaitan. Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan rawatan palsu (ujian khi-kuasa dua). n=96.
Menariknya, penambahan rantai sisi alkil yang lebih panjang daripada C9 mengurangkan aktiviti perencatan, menunjukkan bahawa sebatian berkaitan asid kumamotoik memerlukan rantai sisi bersaiz tertentu untuk menunjukkan aktiviti biologi mereka.
Oleh kerana analisis hubungan struktur-aktiviti menunjukkan bahawa C9 telah diubah suai kepada asid ursonik dan terbitan noniloksi asid ursonik (selepas ini dirujuk sebagai KAND 11) merupakan perencat pertumbuhan tumbuhan yang paling berkesan, kami menjalankan pencirian KAND 11 yang lebih terperinci. Rawatan Arabidopsis dengan 50 μM KAND 11 hampir sepenuhnya menghalang percambahan, manakala kepekatan KAND 11 yang lebih rendah (40, 30, 20, atau 10 μM) menghalang pertumbuhan akar secara bergantung dos (Rajah 4a, b). Untuk menguji sama ada KAND 11 mempengaruhi daya maju meristem akar, kami memeriksa meristem akar yang diwarnakan dengan propidium iodida (PI) dan mengukur saiz kawasan meristem. Saiz meristem anak benih yang ditanam pada medium yang mengandungi 25 μM KAND-11 ialah 151.1 ± 32.5 μm, manakala saiz meristem anak benih yang ditanam pada medium kawalan yang mengandungi DMSO ialah 264.7 ± 30.8 μm (Rajah 4c, d), yang menunjukkan bahawa KAND-11 memulihkan aktiviti selular. penyebaran. Meristem akar. Selaras dengan ini, rawatan KAND 11 mengurangkan jumlah penanda pembahagian sel CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS isyarat dalam meristem akar (Rajah 4e) 17. Keputusan ini menunjukkan bahawa KAND 11 menghalang pertumbuhan akar dengan mengurangkan aktiviti percambahan sel.
Analisis kesan perencatan derivatif asid urbenonik (derivatif urbenyloksi) terhadap pertumbuhan. (a) Anak benih Col jenis liar berusia 7 hari yang ditanam pada plat MS dengan kepekatan KAND 11 yang ditunjukkan. Bar skala = 1 cm. (b) Kuantifikasi panjang akar. Huruf menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Data ditunjukkan sebagai min ± SD. (c) Mikroskopi konfokal akar Col jenis liar berwarna propidium iodida yang ditanam pada plat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11. Kurungan putih menunjukkan meristem akar. Bar skala = 100 µm. (d) Kuantifikasi saiz meristem akar (n = 10 hingga 11). Perbezaan statistik ditentukan menggunakan ujian-t (p< 0.05). Bar mewakili saiz meristem purata. (e) Mikroskopi kontras gangguan pembezaan (DIC) meristem akar yang mengandungi konstruk CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS diwarnakan dan diwarnakan pada anak benih berusia 5 hari yang ditanam pada plat MS dengan atau tanpa ujian KAND 25 µM.
Fitotoksisiti KAND 11 telah diuji selanjutnya menggunakan tumbuhan dikotiledon lain, tembakau (Nicotiana tabacum), dan organisma model tumbuhan darat utama, lumut hati (Marchantia polymorpha). Seperti dalam kes Arabidopsis, anak benih tembakau SR-1 yang ditanam pada medium yang mengandungi 25 μM KAND 11 menghasilkan akar yang lebih pendek (Rajah 5a). Selain itu, 40 daripada 48 biji benih bercambah pada plat yang mengandungi 200 μM KAND 11, manakala semua 48 biji benih bercambah pada media yang dirawat secara olok-olok, menunjukkan bahawa kepekatan KAND yang lebih tinggi adalah signifikan (p< 0.05; ujian chi-square) menghalang percambahan tembakau. (Rajah 5b). Di samping itu, kepekatan KAND 11 yang menghalang pertumbuhan bakteria dalam lumut hati adalah serupa dengan kepekatan berkesan dalam Arabidopsis (Rajah 5c). Keputusan ini menunjukkan bahawa KAND 11 boleh menghalang pertumbuhan pelbagai tumbuhan. Kami kemudian mengkaji kemungkinan sitotoksisiti sebatian berkaitan monoamida beruang dalam organisma lain, iaitu sel HeLa manusia dan strain Escherichia coli DH5α, masing-masing sebagai wakil sel haiwan dan bakteria yang lebih tinggi. Dalam satu siri ujian percambahan sel, kami mendapati bahawa coumamonamide 1, asid coumamonamidic 6, dan KAND 11 tidak menjejaskan pertumbuhan sel HeLa atau E. coli pada kepekatan 100 μM (Rajah 5d,e).
Perencatan pertumbuhan KAND 11 dalam organisma bukan Arabidopsis. (a) Anak benih tembakau SR-1 jenis liar berusia dua minggu ditanam pada plat MS yang diletakkan secara menegak yang mengandungi 25 μM KAND 11. (b) Anak benih tembakau SR-1 jenis liar berusia dua minggu ditanam pada plat MS yang diletakkan secara mendatar yang mengandungi 200 μM KAND 11. (c) Tunas lumut hati Tak-1 jenis liar berusia dua minggu yang ditanam pada plat Gamborg B5 dengan kepekatan KAND 11 yang ditunjukkan. Anak panah merah menunjukkan spora yang berhenti tumbuh dalam tempoh pengeraman dua minggu. (d) Ujian percambahan sel sel HeLa. Bilangan sel yang berdaya maju diukur pada selang masa tetap menggunakan kit pengiraan sel 8 (Dojindo). Sebagai kawalan, sel HeLa dirawat dengan 5 μg/ml aktinomisin D (Act D), yang menghalang transkripsi RNA polimerase dan menyebabkan kematian sel. Analisis dilakukan dalam tiga kali ganda. (e) Ujian percambahan sel E. coli. Pertumbuhan E. coli dianalisis dengan mengukur OD600. Sebagai kawalan, sel telah dirawat dengan ampisilin (Amp) 50 μg/ml, yang menghalang sintesis dinding sel bakteria. Analisis telah dijalankan dalam tiga kali ganda.
Untuk menguraikan mekanisme tindakan sitotoksisiti yang disebabkan oleh sebatian berkaitan uramide, kami menganalisis semula derivatif asid urbenik dengan kesan perencatan sederhana seperti yang ditunjukkan pada gambar. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2b, 6a, anak benih yang ditanam pada plat agar yang mengandungi kepekatan tinggi (200 μM) asid urmotonik 6 menghasilkan akar yang lebih pendek dan melengkung ke kiri (θ = – 23.7 ± 6.1), manakala anak benih yang ditanam pada medium kawalan, anak benih menghasilkan akar yang hampir lurus (θ = – 3.8 ± 7.1). Pertumbuhan serong yang khas ini diketahui berpunca daripada disfungsi mikrotubul kortikal14,18. Selaras dengan penemuan ini, ubat penyahstabilan mikrotubul disopiramid dan oryzalin mendorong kecondongan akar yang serupa di bawah keadaan pertumbuhan kami (Rajah 2b, 6a). Pada masa yang sama, kami menguji derivatif asid urmotonik dan memilih beberapa daripadanya yang, pada kepekatan tertentu, mendorong pertumbuhan akar serong. Sebatian 8, 9, dan 15 mengubah arah pertumbuhan akar masing-masing pada 75 μM, 50 μM, dan 40 μM, menunjukkan bahawa sebatian ini boleh menyahstabilkan mikrotubul secara berkesan (Rajah 2b, 6a). Kami juga menguji derivatif asid ursolik yang paling kuat, KAND 11, pada kepekatan yang lebih rendah (15 µM) dan mendapati bahawa penggunaan KAND 11 menghalang pertumbuhan akar dan arah pertumbuhan akar adalah tidak sekata, walaupun ia cenderung condong ke kiri (Rajah C3). Oleh kerana kepekatan ubat penyahstabilan mikrotubul yang lebih tinggi kadangkala menghalang pertumbuhan tumbuhan dan bukannya menyebabkan kecondongan akar, kami kemudiannya menilai kemungkinan bahawa KAND 11 mempengaruhi mikrotubul dengan memerhatikan mikrotubul kortikal dalam sel epidermis akar. Imunohistokimia menggunakan antibodi anti-β-tubulin dalam sel epidermis akar anak benih yang dirawat dengan 25 μM KAND 11 menunjukkan kehilangan hampir semua mikrotubul kortikal dalam sel epidermis dalam zon pemanjangan (Rajah 6b). Keputusan ini menunjukkan bahawa asid kumamotonik dan derivatifnya bertindak secara langsung atau tidak langsung pada mikrotubul untuk mengganggunya dan sebatian ini merupakan perencat mikrotubul baharu.
Asid Ursonik dan derivatifnya mengubah mikrotubul kortikal dalam Arabidopsis thaliana. (a) Sudut kecondongan akar diukur dengan kehadiran pelbagai derivatif asid urmotonik pada kepekatan yang ditunjukkan. Kesan dua sebatian yang diketahui menghalang mikrotubul: disopiramid dan oryzalin juga dianalisis. Sisipan menunjukkan piawaian yang digunakan untuk mengukur sudut pertumbuhan akar. Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan rawatan palsu (ujian t, p< 0.05). n>19. Bar skala = 1 cm. (b) Mikrotubul kortikal dalam sel epidermis dalam zon pemanjangan. Mikrotubul dalam akar Arabidopsis Col jenis liar yang ditanam pada plat MS dengan atau tanpa 25 μM KAND 11 telah divisualisasikan melalui pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi primer β-tubulin dan antibodi sekunder terkonjugasi Alexa Fluor. Bar skala = 10 µm. (c) Struktur mitosis mikrotubul dalam meristem akar. Mikrotubul telah divisualisasikan menggunakan pewarnaan imunohistokimia. Struktur mitosis, termasuk zon profasa, gelendong dan fragmoplas, dikira daripada imej konfokal. Anak panah menunjukkan struktur mikrotubul mitosis. Asterisk menunjukkan perbezaan yang ketara dengan rawatan palsu (ujian t, p< 0.05). n>9. Bar skala = 50 µm.
Walaupun Ursa mempunyai keupayaan untuk mengganggu fungsi mikrotubul, mekanisme tindakannya dijangka berbeza daripada agen penyahpolimeran mikrotubul biasa. Contohnya, kepekatan agen penyahpolimeran mikrotubul yang lebih tinggi seperti disopiramid dan oryzalin mendorong pengembangan anisotropik sel epidermis, manakala KAND 11 tidak. Di samping itu, penggunaan bersama KAND 11 dan disopiramid menghasilkan tindak balas pertumbuhan akar yang disebabkan oleh disopiramid dan perencatan pertumbuhan yang disebabkan oleh KAND 11 diperhatikan (Rajah S4). Kami juga menganalisis tindak balas mutan disopiramid 1-1 (phs1-1) hipersensitif terhadap KAND 11. phs1-1 mempunyai mutasi titik tubulin kinase bukan kanonik dan menghasilkan akar yang lebih pendek apabila dirawat dengan disopiramid9,20. Anak benih mutan phs1-1 yang ditanam pada medium agar yang mengandungi KAND 11 mempunyai akar yang lebih pendek sama seperti yang ditanam pada disopiramid (rajah S5).
Di samping itu, kami memerhatikan struktur mikrotubul mitosis, seperti zon profasa, gelendong dan fragmoplas, dalam meristem akar anak benih yang dirawat dengan KAND 11. Selaras dengan pemerhatian untuk CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, penurunan ketara dalam bilangan mikrotubul mitosis telah diperhatikan (Rajah .6c).
Untuk mencirikan sitotoksisiti KAND 11 pada resolusi subselular, kami merawat sel suspensi BY-2 tembakau dengan KAND 11 dan memerhatikan tindak balasnya. Kami mula-mula menambahkan KAND 11 pada sel BY-2 yang mengekspresikan TagRFP-TUA6, yang melabel mikrotubul secara fluoresen, untuk menilai kesan KAND 11 pada mikrotubul kortikal. Ketumpatan mikrotubul kortikal dinilai menggunakan analisis imej, yang mengukur peratusan piksel sitoskeletal antara piksel sitoplasma. Keputusan ujian menunjukkan bahawa selepas rawatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam, ketumpatan menurun dengan ketara kepada 0.94 ± 0.74% atau 0.23 ± 0.28%, masing-masing, manakala ketumpatan sel yang dirawat dengan DMSO, berjumlah 1.61 ± 0.34% (Rajah 7a). Keputusan ini selaras dengan pemerhatian dalam Arabidopsis bahawa rawatan KAND 11 mendorong penyahpolimeran mikrotubul kortikal (Rajah 6b). Kami juga memeriksa garisan BY-2 dengan filamen aktin berlabel GFP-ABD selepas rawatan dengan kepekatan KAND 11 yang sama dan mendapati bahawa rawatan KAND 11 mengganggu filamen aktin. Rawatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND 11 selama 1 jam masing-masing mengurangkan ketumpatan filamen aktin dengan ketara kepada 1.20 ± 0.62% atau 0.61 ± 0.26%, manakala ketumpatan dalam sel yang dirawat DMSO ialah 1.69 ± 0.51% (Rajah 2). 7b). Keputusan ini berbeza dengan kesan propyzamide, yang tidak menjejaskan filamen aktin, dan latrunculin B, penyahpolimer aktin yang tidak menjejaskan mikrotubul (Rajah SI S6). Di samping itu, rawatan dengan coumamonamide 1, asid coumamonamide 6, atau KAND 11 tidak menjejaskan mikrotubul dalam sel HeLa (Rajah SI S7). Oleh itu, mekanisme tindakan KAND 11 dipercayai berbeza daripada pengganggu sitoskeleton yang diketahui. Di samping itu, pemerhatian mikroskopik kami terhadap sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 mendedahkan permulaan kematian sel semasa rawatan KAND 11 dan menunjukkan bahawa perkadaran sel mati berwarna biru Evans tidak meningkat dengan ketara selepas 30 minit rawatan KAND 11, manakala selepas 90 minit rawatan dengan 50 μM atau 100 μM KAND, bilangan sel mati masing-masing meningkat kepada 43.7% atau 80.1% (Rajah 7c). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahawa derivatif asid ursolik baharu KAND 11 ialah perencat sitoskeleton khusus tumbuhan dengan mekanisme tindakan yang sebelum ini tidak diketahui.
KAND mempengaruhi mikrotubul kortikal, filamen aktin dan daya hidup sel BY-2 tembakau. (a) Visualisasi mikrotubul kortikal dalam sel BY-2 dengan kehadiran TagRFP-TUA6. Sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO telah diperiksa melalui mikroskopi konfokal. Ketumpatan mikrotubul kortikal dikira daripada mikrograf 25 sel bebas. Huruf menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian Tukey HSD, p< 0.05). Bar skala = 10 µm. (b) Filamen aktin kortikal dalam sel BY-2 divisualisasikan dengan kehadiran GFP-ABD2. Sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO telah diperiksa melalui mikroskopi konfokal. Ketumpatan filamen aktin kortikal dikira daripada mikrograf 25 sel bebas. Huruf menunjukkan perbezaan yang ketara (ujian Tukey HSD, p< 0.05). Bar skala = 10 µm. (c) Pemerhatian sel BY-2 mati melalui pewarnaan biru Evans. Sel BY-2 yang dirawat dengan KAND 11 (50 μM atau 100 μM) atau DMSO telah diperiksa melalui mikroskopi medan terang. n=3. Bar skala = 100 µm.
Penemuan dan aplikasi produk semula jadi baharu telah membawa kepada kemajuan yang ketara dalam pelbagai aspek kehidupan manusia, termasuk perubatan dan pertanian. Penyelidikan sejarah telah dijalankan untuk mendapatkan sebatian berguna daripada sumber semula jadi. Khususnya, aktinomiset diketahui berguna sebagai antibiotik antiparasit untuk nematod kerana keupayaannya menghasilkan pelbagai metabolit sekunder seperti avermectin, sebatian utama ivermectin dan bleomycin dan derivatifnya, yang digunakan secara perubatan sebagai agen antikanser21,22. Begitu juga, pelbagai sebatian herbisida telah ditemui daripada aktinomiset, yang sebahagiannya telah digunakan secara komersial1,23. Oleh itu, analisis metabolit aktinomiset untuk mengasingkan produk semula jadi dengan aktiviti biologi yang diingini dianggap sebagai strategi yang berkesan. Dalam kajian ini, kami menemui sebatian baharu, coumamonamide, daripada S. werraensis dan berjaya mensintesisnya. Asid ursonik ialah perantaraan sintetik urbenamide dan derivatifnya. Ia boleh menyebabkan keriting akar yang tersendiri, mempamerkan aktiviti herbisida sederhana hingga kuat, dan secara langsung atau tidak langsung merosakkan mikrotubul tumbuhan. Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan asid urmotonik mungkin berbeza daripada perencat mikrotubul sedia ada, kerana KAND 11 juga mengganggu filamen aktin dan menyebabkan kematian sel, menunjukkan mekanisme pengawalseliaan di mana asid urmotonik dan derivatifnya mempengaruhi pelbagai struktur sitoskeletal.
Pencirian asid urbenonik yang lebih terperinci akan membantu untuk lebih memahami mekanisme tindakan asid urbenonik. Khususnya, matlamat seterusnya adalah untuk menilai keupayaan asid ursonik untuk mengikat mikrotubul yang dikurangkan untuk menentukan sama ada asid ursonik dan derivatifnya bertindak secara langsung pada mikrotubul dan mendepolimerisasikannya, atau sama ada tindakannya mengakibatkan ketidakstabilan mikrotubul. Di samping itu, dalam kes di mana mikrotubul bukan sasaran langsung, mengenal pasti tapak tindakan dan sasaran molekul asid ursonik pada sel tumbuhan akan membantu lebih memahami sifat sebatian berkaitan dan cara yang mungkin untuk meningkatkan aktiviti herbisida. Ujian bioaktiviti kami mendedahkan keupayaan sitotoksik unik asid ursonik terhadap pertumbuhan tumbuhan seperti Arabidopsis thaliana, tembakau dan lumut hati, manakala E. coli mahupun sel HeLa tidak terjejas. Ketoksikan yang sedikit atau tiada langsung terhadap sel haiwan adalah kelebihan derivatif asid ursonik jika ia dibangunkan sebagai racun herba untuk digunakan dalam ladang pertanian terbuka. Sesungguhnya, memandangkan mikrotubul adalah struktur biasa dalam eukariota, perencatan selektifnya dalam tumbuhan adalah keperluan utama untuk racun herba. Contohnya, propyzamide, agen penyahpolimeran mikrotubul yang mengikat secara langsung pada tubulin dan menghalang pempolimeran, digunakan sebagai racun herba kerana ketoksikannya yang rendah terhadap sel haiwan24. Berbeza dengan disopiramid, benzamida yang berkaitan mempunyai kekhususan sasaran yang berbeza. Selain mikrotubul tumbuhan, RH-4032 atau benzoksamid juga menghalang mikrotubul sel haiwan atau oomiset, masing-masing, dan zalilamide digunakan sebagai racun kulat kerana fitotoksisitinya yang rendah25,26,27. Beruang yang baru ditemui dan derivatifnya mempamerkan sitotoksisiti selektif terhadap tumbuhan, tetapi perlu diingatkan bahawa pengubahsuaian selanjutnya boleh mengubah kekhususan sasarannya, yang berpotensi memberikan derivatif tambahan untuk mengawal kulat patogen atau oomiset.
Sifat unik asid urbenonik dan derivatifnya berguna untuk pembangunannya sebagai racun herba dan digunakan sebagai alat penyelidikan. Kepentingan sitoskeleton dalam mengawal bentuk sel tumbuhan telah diiktiraf secara meluas. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa tumbuhan telah mengembangkan mekanisme kompleks organisasi mikrotubul kortikal dengan mengawal dinamik mikrotubul untuk mengawal morfogenesis dengan betul. Sebilangan besar molekul yang bertanggungjawab untuk pengawalaturan aktiviti mikrotubul telah dikenal pasti, dan penyelidikan berkaitan masih berterusan3,4,28. Pemahaman semasa kita tentang dinamik mikrotubul dalam sel tumbuhan tidak menjelaskan sepenuhnya mekanisme organisasi mikrotubul kortikal. Contohnya, walaupun kedua-dua disopiramid dan oryzalin boleh menyahpolimerisasi mikrotubul, disopiramid menyebabkan herotan akar yang teruk manakala oryzalin mempunyai kesan yang agak ringan. Selain itu, mutasi dalam tubulin, yang menstabilkan mikrotubul, juga menyebabkan dektrorotasi dalam akar, manakala paclitaxel, yang juga menstabilkan dinamik mikrotubul, tidak. Oleh itu, mengkaji dan mengenal pasti sasaran molekul asid ursolik harus memberikan pandangan baharu tentang pengawalaturan mikrotubul kortikal tumbuhan. Begitu juga, perbandingan bahan kimia yang berkesan dalam menggalakkan pertumbuhan yang terganggu, seperti disopiramid, dan bahan kimia yang kurang berkesan, seperti oryzalin atau asid kumamotorik, pada masa hadapan akan memberikan petunjuk tentang bagaimana pertumbuhan yang terganggu berlaku.
Sebaliknya, penyusunan semula sitoskeleton yang berkaitan dengan pertahanan adalah satu lagi kemungkinan untuk menjelaskan sitotoksisiti asid ursonik. Jangkitan patogen atau pengenalan elisitor ke dalam sel tumbuhan kadangkala menyebabkan kemusnahan sitoskeleton dan kematian sel berikutnya29. Contohnya, kriptoksantin yang berasal dari oomiset telah dilaporkan mengganggu mikrotubul dan filamen aktin sebelum kematian sel tembakau, serupa dengan apa yang berlaku dengan rawatan KAND30,31. Persamaan antara tindak balas pertahanan dan tindak balas selular yang disebabkan oleh asid ursonik mendorong kami untuk membuat hipotesis bahawa ia mencetuskan proses selular yang biasa, walaupun kesan asid ursonik yang lebih cepat dan lebih kuat daripada kriptoksantin adalah jelas. Walau bagaimanapun, kajian telah menunjukkan bahawa gangguan filamen aktin menggalakkan kematian sel spontan, yang tidak selalunya disertai dengan gangguan mikrotubul29. Di samping itu, masih belum dapat dilihat sama ada patogen atau elisitor menyebabkan pertumbuhan akar yang terganggu, seperti yang dilakukan oleh derivatif asid ursonik. Oleh itu, pengetahuan molekul yang menghubungkan tindak balas pertahanan dan sitoskeleton adalah masalah yang menarik untuk ditangani. Dengan mengeksploitasi kehadiran sebatian berat molekul rendah yang berkaitan dengan asid ursonik, serta pelbagai derivatif dengan pelbagai potensi, ia mungkin memberi peluang untuk menyasarkan mekanisme selular yang tidak diketahui.
Secara keseluruhannya, penemuan dan aplikasi sebatian baharu yang memodulasi dinamik mikrotubul akan menyediakan kaedah yang ampuh untuk menangani mekanisme molekul kompleks yang mendasari penentuan bentuk sel tumbuhan. Dalam konteks ini, sebatian asid urmotonik yang baru dibangunkan, yang mempengaruhi mikrotubul dan filamen aktin dan mendorong kematian sel, mungkin memberi peluang untuk menguraikan hubungan antara kawalan mikrotubul dan mekanisme lain ini. Oleh itu, analisis kimia dan biologi menggunakan asid urbenonik akan membantu kita memahami mekanisme pengawalseliaan molekul yang mengawal sitoskeleton tumbuhan.
Inokulasikan S. werraensis MK493-CF1 ke dalam kelalang Erlenmeyer berselerak 500 mL yang mengandungi 110 mL medium biji benih yang terdiri daripada 2% (b/v) galaktosa, 2% (b/v) pes pati, 1% (b/v) komposisi Bacto.-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (b/v) ekstrak jagung (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepun), 0.2% (b/v) (NH4)2SO4 dan 0.2% CaCO3 dalam air ternyahion. (pH 7.4 sebelum pensterilan). Kultur biji benih diinkubasi pada penggoncang berputar (180 rpm) pada suhu 27°C selama 2 hari. Penanaman pengeluaran melalui penapaian keadaan pepejal. Kultur benih (7 ml) telah dipindahkan ke dalam kelalang K-1 500 ml yang mengandungi 40 g medium pengeluaran yang terdiri daripada 15 g barli tekan (MUSO Co., Ltd., Jepun) dan 25 g air ternyahion (pH tidak diselaraskan sebelum pensterilan). Penapaian dijalankan pada suhu 30°C dalam keadaan gelap selama 14 hari. Bahan penapaian diekstrak dengan 40 ml/botol EtOH dan disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 minit). Supernatan kultur (60 ml) telah diekstrak dengan campuran 10% MeOH/EtOAc. Lapisan organik telah disejat di bawah tekanan yang dikurangkan untuk mendapatkan sisa (59.5 mg), yang telah tertakluk kepada HPLC dengan elusi kecerunan (0–10 minit: 90%) pada lajur fasa terbalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minit: 90% H2O/CH3CN kepada 70% H2O/CH3CN (kecerunan), 35–45 minit: 90% H2O/EtOH, 45–155 minit: 90% H2O/EtOH kepada 100% EtOH (kecerunan (kecerunan), 155–200 min: 100% EtOH) pada kadar aliran 1.5 ml/min, kumamonamide (1, 36.0 mg) telah diasingkan sebagai serbuk amorfus putih.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai terkira: 141.0659, nilai terukur: 141.0663, IR νmaks 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Benih Columbia (Col-0) diperoleh daripada Pusat Sumber Biologi Arabidopsis (ABRC) dengan kebenaran untuk kegunaan penyelidikan. Benih Col-0 telah dibiakkan dan dikekalkan di bawah keadaan makmal kami dan digunakan sebagai tumbuhan Arabidopsis jenis liar. Benih Arabidopsis telah disterilkan permukaan dan dikultur dalam medium Murashige dan Skoog separuh kekuatan yang mengandungi 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)etanesulfonik asid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) dan 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, pada suhu 23 °C dan cahaya malar. Benih mutan phs1-1 disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara).
Benih strain SR-1 telah disediakan oleh T. Hashimoto (Institut Sains dan Teknologi Nara) dan digunakan sebagai tanaman tembakau jenis liar. Benih tembakau telah disterilkan permukaan dan direndam dalam air steril selama tiga malam untuk menggalakkan percambahan, kemudian diletakkan dalam larutan separuh kekuatan yang mengandungi 2% sukrosa, 0.05% (b/v) MES, dan 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. dan medium Skoog) dengan pH 5.7 dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya malar.
Strain Tak-1 disediakan oleh T. Kohchi (Universiti Kyoto) dan digunakan sebagai unit eksperimen piawai untuk kajian lumut hati. Gemma diperoleh daripada tumbuhan kultur yang disterilkan dan kemudian disalut pada medium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yang mengandungi 1% sukrosa dan 0.3% gam gellan dan diinkubasi pada suhu 23°C di bawah cahaya berterusan.
Sel BY-2 tembakau (Nicotiana tabacum L. cv. Kuning Terang 2) telah disediakan oleh S. Hasezawa (Universiti Tokyo). Sel BY-2 telah dicairkan sebanyak 95 kali ganda dalam medium Linsmeier dan Skoog yang diubah suai dan ditambah setiap minggu dengan asid 2,4-diklorofenoksiasetik 32. Suspensi sel telah dicampurkan pada penggoncang berputar pada 130 rpm pada suhu 27°C dalam keadaan gelap. Basuh sel dengan 10 kali ganda isipadu medium segar dan larutkan semula dalam medium yang sama. Garisan sel transgenik BY-2 yang mengekspresikan penanda mikrotubul TagRFP-TUA6 atau penanda filamen aktin GFP-ABD2 secara stabil di bawah promoter virus mozek kembang kol 35S telah dijana seperti yang diterangkan 33,34,35. Garisan sel ini boleh dikekalkan dan disegerakkan menggunakan prosedur yang serupa dengan yang digunakan untuk garisan sel BY-2 asal.
Sel HeLa telah dikultur dalam medium Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) (Life Technologies) yang ditambah dengan 10% serum lembu janin, 1.2 U/ml penisilin dan 1.2 μg/ml streptomisin dalam inkubator 37°C dengan 5% CO2.
Semua eksperimen yang diterangkan dalam manuskrip ini telah dijalankan mengikut peraturan dan garis panduan biokeselamatan Jepun.
Sebatian dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sebagai larutan stok dan dicairkan dalam medium MS untuk Arabidopsis dan medium tembakau atau Gamborg B5 untuk lumut hati. Untuk ujian perencatan pertumbuhan akar, lebih daripada 10 biji benih setiap plat disemai pada medium agar yang mengandungi sebatian yang ditunjukkan atau DMSO. Benih diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 7 hari. Anak benih diambil gambarnya dan panjang akar diukur. Untuk ujian percambahan Arabidopsis, 48 biji benih setiap plat disemai pada medium agar yang mengandungi sebatian 200 μM atau DMSO. Benih Arabidopsis ditanam dalam ruang pertumbuhan dan bilangan anak benih yang bercambah dikira 7 hari selepas percambahan (dag). Untuk ujian percambahan tembakau, 24 biji benih setiap plat disemai pada medium agar yang mengandungi 200 μM KAND atau DMSO. Benih tembakau ditanam dalam ruang pertumbuhan dan bilangan anak benih yang bercambah dikira selepas 14 hari. Bagi ujian perencatan pertumbuhan lumut hati, 9 embrio daripada setiap plat telah disalut pada medium agar yang mengandungi kepekatan KAND atau DMSO yang ditunjukkan dan diinkubasi dalam ruang pertumbuhan selama 14 hari.
Gunakan anak benih yang diwarnakan dengan 5 mg/ml propidium iodida (PI) untuk menggambarkan organisasi meristem akar. Isyarat PI diperhatikan melalui mikroskopi pendarfluor menggunakan mikroskop pengimbasan laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar dengan β-glukuronidase (GUS) telah dilakukan mengikut protokol yang diterangkan oleh Malami dan Benfey36. Anak benih difiksasi dalam 90% aseton semalaman, diwarnakan dengan 0.5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-asid glukuronik dalam penimbal GUS selama 1 jam dan diletakkan dalam larutan kloraldehid terhidrat (8 g kloral hidrat, 2 ml air dan 1 ml gliserol) dan diperhatikan melalui mikroskopi kontras gangguan pembezaan menggunakan mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur pada anak benih berusia 7 hari yang ditanam di atas plat yang diletakkan secara menegak. Ukur sudut akar dari arah vektor graviti seperti yang diterangkan dalam langkah 6.
Susunan mikrotubul kortikal diperhatikan seperti yang diterangkan, dengan pengubahsuaian kecil pada protokol 37. Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) dan IgG anti-tikus terkonjugasi Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) telah digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder pada pencairan 1:1000 dan 1:100. Imej pendarfluor diperoleh menggunakan mikroskop pengimbasan laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Dapatkan imej susunan-Z dan cipta unjuran keamatan maksimum mengikut arahan pengilang.
Ujian percambahan sel HeLa telah dijalankan menggunakan Kit Pengiraan Sel 8 (Dojindo) mengikut arahan pengilang.
Pertumbuhan E. coli DH5α dianalisis dengan mengukur ketumpatan sel dalam kultur menggunakan spektrofotometer pada 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dalam sel BY-2 transgenik diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor yang dilengkapi dengan peranti pengimbasan confocal CSU-X1 (Yokogawa) dan kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Ketumpatan sitoskeletal dinilai melalui analisis imej, yang mengukur peratusan piksel sitoskeletal antara piksel sitoplasma dalam imej confocal menggunakan perisian ImageJ seperti yang diterangkan38,39.
Untuk mengesan kematian sel dalam sel BY-2, sebahagian daripada suspensi sel diinkubasi dengan 0.05% biru Evans selama 10 minit pada suhu bilik. Pewarnaan biru Evans terpilih bagi sel mati bergantung pada penyemperitan pewarna daripada sel yang hidup oleh membran plasma yang utuh40. Sel yang diwarnakan diperhatikan menggunakan mikroskop medan terang (BX53, Olympus).
Sel HeLa ditumbuhkan dalam DMEM yang ditambah dengan 10% FBS dalam inkubator lembap pada suhu 37°C dan 5% CO2. Sel dirawat dengan 100 μM KAND 11, asid kumamonamik 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), atau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) selama 6 jam pada suhu 37°C. Sel difiksasi dengan MetOH selama 10 minit dan kemudian dengan asetat selama 5 minit pada suhu bilik. Sel yang difiksasi diinkubasi dengan antibodi primer β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) yang dicairkan dalam 0.5% BSA/PBS selama 2 jam, dibasuh 3 kali dengan TBST, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi kambing Alexa Fluor. 488 1 jam. – IgG tikus (Thermo Fisher Scientific: A11001) dan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) yang dicairkan dalam 0.5% BSA/PBS. Selepas dibasuh dengan TBST sebanyak tiga kali, sel-sel yang diwarnakan diperhatikan pada mikroskop terbalik Nikon Eclipse Ti-E. Imej telah ditangkap dengan kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 yang disejukkan menggunakan perisian MetaMorph (Molecular Devices).
Masa siaran: 17 Jun 2024